长片段PCR扩增中几个常见问题的解决办法!
丁香园论坛
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1.当PCR结果不满意时,考虑以下几个方面:(1)将PCR反应的试管与反应板紧贴,(2)使用50ul或更少反应体系时,勿使用AmpliWax,两个反应混合液=的操作方式在大多数情况下很有效,(3)当酶反应混合物以70度"热启动"开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0.2ml的PCR管不能均匀传热.(4)不要随意减少dNTP的用量,必需与其他成分保持平衡.
2.没有扩增产物:(1)在提供氯化镁缓冲液中,以0.25mmol/L为梯度增加氯化镁浓度,(2)泳道中出现模糊条带,如果DNA模板中存在RNA,按上诉提示浓度补加氯化镁,因为在PCR反应中可能缺少游离的镁离子.(3)在融化试剂时,将第三缓冲液在15-25度温育后混匀,若还有晶体状物质,放置过夜混匀后可再次使用.(4)检查退火温度和变性条件,如果需要可降低退火温度.(5)检查模板和引物的用量.(6)增加循环次数和/或模板DNA的用量.
3.泳道中出现模糊条带:(1)减少循环次数或模板DNA的用量,(2)提高退火温度,单不要超过68度,(3)重新设计引物或设计更长的引物.
4其他值得注意的条件:(1)建议使用0.2ml的薄壁管,因为厚壁管在92度时不能有效的使模板变性.(2)最佳反应体积为50ul,最好泳30ul矿物油覆盖,(3)在大多数反应中,0.75ul(0.5-1.0ul)的酶量可以得到满意的结果,(4)建议使用1.75mmol/L氯化镁:350mmol/LdNTP或2.25mmol/L氯化镁:500LNTP组合的混合物,要得到最佳结果,优化镁离子的浓度是必需的.(5)基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应,因此最好泳琼脂糖凝胶电泳检测DNA的长度.DNA片段长度可以超过50KB,传统的基因组DNA能扩增片段至10KB,(6)要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA.(7)降低二级结构和引物二聚物形成的可能性.进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为24-34个核苷酸,熔点在63068度之间,使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性,这点非常重要,长片段扩增的效果往往受到非特异性短片度优先扩增的影响,(8)变性:第一步变性在92-94度下进行2分钟,在循环过程中尽可能减少变性时间(92-94度下19秒),除非模板中富含GC,则95度下变性30秒,这可以防止DNA脱平嘌呤核链断裂,对于需扩增的基因组DNA片段终长度超过12KB时,应尽可能降低变性温度.(9)延伸:68度下进行延伸.(10)循环延伸:尽量采用循环延伸的条件,若PCR仪无此功能,则必需增加延伸的时间.(11)长片段PCR系统扩增的片段其3'-末端油一个突出的A,因此建议采用T/A克隆.若进行平端克隆,可用Klenow酶或T4DNA多聚酶将PCR产物补平后在进行.(12)测序时因酶的混合物带有3'-5'外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一的(染色体)带型.
2.没有扩增产物:(1)在提供氯化镁缓冲液中,以0.25mmol/L为梯度增加氯化镁浓度,(2)泳道中出现模糊条带,如果DNA模板中存在RNA,按上诉提示浓度补加氯化镁,因为在PCR反应中可能缺少游离的镁离子.(3)在融化试剂时,将第三缓冲液在15-25度温育后混匀,若还有晶体状物质,放置过夜混匀后可再次使用.(4)检查退火温度和变性条件,如果需要可降低退火温度.(5)检查模板和引物的用量.(6)增加循环次数和/或模板DNA的用量.
3.泳道中出现模糊条带:(1)减少循环次数或模板DNA的用量,(2)提高退火温度,单不要超过68度,(3)重新设计引物或设计更长的引物.
4其他值得注意的条件:(1)建议使用0.2ml的薄壁管,因为厚壁管在92度时不能有效的使模板变性.(2)最佳反应体积为50ul,最好泳30ul矿物油覆盖,(3)在大多数反应中,0.75ul(0.5-1.0ul)的酶量可以得到满意的结果,(4)建议使用1.75mmol/L氯化镁:350mmol/LdNTP或2.25mmol/L氯化镁:500LNTP组合的混合物,要得到最佳结果,优化镁离子的浓度是必需的.(5)基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应,因此最好泳琼脂糖凝胶电泳检测DNA的长度.DNA片段长度可以超过50KB,传统的基因组DNA能扩增片段至10KB,(6)要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA.(7)降低二级结构和引物二聚物形成的可能性.进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为24-34个核苷酸,熔点在63068度之间,使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性,这点非常重要,长片段扩增的效果往往受到非特异性短片度优先扩增的影响,(8)变性:第一步变性在92-94度下进行2分钟,在循环过程中尽可能减少变性时间(92-94度下19秒),除非模板中富含GC,则95度下变性30秒,这可以防止DNA脱平嘌呤核链断裂,对于需扩增的基因组DNA片段终长度超过12KB时,应尽可能降低变性温度.(9)延伸:68度下进行延伸.(10)循环延伸:尽量采用循环延伸的条件,若PCR仪无此功能,则必需增加延伸的时间.(11)长片段PCR系统扩增的片段其3'-末端油一个突出的A,因此建议采用T/A克隆.若进行平端克隆,可用Klenow酶或T4DNA多聚酶将PCR产物补平后在进行.(12)测序时因酶的混合物带有3'-5'外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一的(染色体)带型.
