【共享】酶切常见问题与原因及解决办法！
丁香园
5244
问题：
原因
解决办法
DNA完全没有被内切酶切割：
1) 内切酶失活
标准底物检测酶活性
2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子
将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3) 条件不适（试剂、温度）
检查反应系统是否最佳
4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化
换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株
5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）
换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增
6) DNA位点上存在其它修饰
将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证
7) DNA不存在该酶识别顺序
换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证
DNA切割不完全：
1) 内切酶活性下降
用5-10倍量过量消化
2) 内切酶稀释不正确
用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
3) DNA不纯，反应条件不佳
同上
4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存其它修饰
同上
5) 部分DNA溶液粘在管壁上
反应前离心数秒
6) 内切酶溶液粘度大，取样不准
将内切酶稀释，增大取样体积
7) 酶切后DNA粘末端退火
电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷
8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性
使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡
9) 过度稀释使酶活性降低
适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏
10)反应条件不适
使用最佳反应体系
11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
加大酶量5-10倍
DNA片段数目多于理伦值：
1) 内切酶星状活性
检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量
2) 其它内切酶污染
用λDNA作底物检查酶切结果
3) 底物中含其它DNA杂质
电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段
酶切后没有观察到DNA片段的存在：
1) DNA定量错误（如RNA含量较高）
用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量
2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀
在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次
内切酶保存期内快速失活：
1) 保存温度不合适
内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存
2) 以稀释形式保存
稀释酶液不宜长期存放，应一次使用
3) 贮藏缓冲液不适当
使用厂家推荐的贮藏缓冲液
4) 低蛋白浓度
内切酶与500ug/ml的BSA一起保存
电泳后DNA片段的带型弥散，不均一：
1) DNA上结合有蛋白质
电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化
2) 内切酶中含有DNA外切酶
减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
酶切后的DNA片段连接效率低：
1) 含磷酸盐的浓度高
透析，乙醇沉淀去除磷酸盐
2) 内切酶失活不全或含有ATP酶
延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
3) 平末端连接
加大T4 DNA Ligase用量
4) 外切酶污染
减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA
5) 连接缓冲液不合适
重新配制连接缓冲液
原因
解决办法
DNA完全没有被内切酶切割：
1) 内切酶失活
标准底物检测酶活性
2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子
将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3) 条件不适（试剂、温度）
检查反应系统是否最佳
4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化
换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株
5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）
换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增
6) DNA位点上存在其它修饰
将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证
7) DNA不存在该酶识别顺序
换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证
DNA切割不完全：
1) 内切酶活性下降
用5-10倍量过量消化
2) 内切酶稀释不正确
用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
3) DNA不纯，反应条件不佳
同上
4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存其它修饰
同上
5) 部分DNA溶液粘在管壁上
反应前离心数秒
6) 内切酶溶液粘度大，取样不准
将内切酶稀释，增大取样体积
7) 酶切后DNA粘末端退火
电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷
8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性
使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡
9) 过度稀释使酶活性降低
适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏
10)反应条件不适
使用最佳反应体系
11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
加大酶量5-10倍
DNA片段数目多于理伦值：
1) 内切酶星状活性
检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量
2) 其它内切酶污染
用λDNA作底物检查酶切结果
3) 底物中含其它DNA杂质
电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段
酶切后没有观察到DNA片段的存在：
1) DNA定量错误（如RNA含量较高）
用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量
2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀
在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次
内切酶保存期内快速失活：
1) 保存温度不合适
内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存
2) 以稀释形式保存
稀释酶液不宜长期存放，应一次使用
3) 贮藏缓冲液不适当
使用厂家推荐的贮藏缓冲液
4) 低蛋白浓度
内切酶与500ug/ml的BSA一起保存
电泳后DNA片段的带型弥散，不均一：
1) DNA上结合有蛋白质
电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化
2) 内切酶中含有DNA外切酶
减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
酶切后的DNA片段连接效率低：
1) 含磷酸盐的浓度高
透析，乙醇沉淀去除磷酸盐
2) 内切酶失活不全或含有ATP酶
延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
3) 平末端连接
加大T4 DNA Ligase用量
4) 外切酶污染
减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA
5) 连接缓冲液不合适
重新配制连接缓冲液
