给大家一个可能有用的东西
丁香园论坛
1663
实时定量PCR应用中的问题及优化方案
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具[1]。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测 荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量[2]。目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增[3,4,5]。本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。
实时定量PCR的应用现状
实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域[3]。
Giulietti 等人[6]对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法（如ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。
众所周知，cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。Rajeevan等人[7]利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。
实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究。例如Laird和他的同事们[8]建立了一种被称作Methylight的实时定量PCR方法，它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时PCR的敏感性和特异性，使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞[9]。又如Sevall等人[10]证明可以用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的杂交效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。
目前实时定量PCR在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上，这一技术对DNA和RNA病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册供人们使用，但是必须明确，国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技术[11]，它是一种利用电化学以光的等温PCR反应，在反应过程中能产生一种与靶RNA反极性的RNA扩增子，分子beacon常用于这种技术 ，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。
常用的热循环仪
对PCR产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种：
1. PE公司生产的Applied Biosystem系列：(1) ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链DNA结合染料、分子beacon原理的分析。一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要2小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析。(2) Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与 ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。(3) ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的仪器，其基本构成与ABI Prism 7700 SDS相同，但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96孔和384孔）。如果加上一个装载辅件，可以在24h之内完成84个384孔板的样本测定。
2. Roche 公司生产的Lightcycler热循环仪，它以能装载20-25ul的毛细硅管作为反应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光源对样本的影响。由二极管发射蓝光激发荧光，并提供三个滤光片，可利用荧光分光测定的原理，同时对一个反应体系的多种荧光进行检测，所以它完全可以进行多重PCR。由于Lightcycler使用了其独特毛细管反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化，从而能在20-30min内快速完成30-40循环，达到样本扩增的目的[12]。Lightcycler通常使用的实验材料主要是SYBRI Green I荧光染料和Taqman荧光探针和杂交探针。虽然Lightcycler有相当多的优点，但是这也有一些不足之处，由于它只提供一个32孔的样品盘，这使得不能在一次进行较多的样本测定。
3. Bio-rad 公司生产的iCycler iQ：这种仪器提供连续的检测波长调节，程序满足实时数据处理，可以同时在一个反应体系中检测四种荧光信号，由于一批能完成96个样本的测定，所以能提供相对较快的扩增反应。
4. Strategene公司的MX4000 Multiplex: 这种仪器的检测波长可在350-750nm范围内进行调节，以卤素灯作为激发光源，常选用的实验材料包括Taqman探针、杂交探针和分子信标（molecular beacon），其样品盘的规格有多处可供选择，包括96孔盘、8联管或单管，其程序也提供实时数据分析。
5. Cepheid公司的Smart Cycler System: 这种仪器正如其名一样具有强大的功能，它有16种反应模式可供选择，而且每种模式都有各自的程序，任一模式不仅能同时检测四种荧光信号，而且不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测。Smart Cycler System的这种设计虽然有其优点，但是其缺点也是显而易见的，由于其将样品盘分得过细，所以不利于同时进行较多样品的分析。
6. Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 这种仪器与Lightcycler相比，属于中心型热循环仪，即从反应体系内部进行热变化；其具有双光源系统，蓝光在470nm处激发荧光，绿光在530nm波长激发荧光；具有两种样品盘（32孔和72孔）供选择；可以对多种荧光材料进行测定 。
荧光材料新进展
为了满足实时PCR更高敏感性要求，各试剂公司都致力于开发新型的化学发光材料，目前作为商业用途的这些化学物质都能适用于上述的各种仪器。它们主要有以下几种：
1. 水解探针或Taqman探针：这种探针用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’à3’活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM（6－羧基荧光素）,TET（四氯－6－羧基荧光素）,JOE（2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基荧光素），HEX（六氯－6－甲基荧光素）或VIC，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或DABCYL（4-（4’-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相较之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的减少自发荧光信号[6]。目前，水解探针已被用于基因检测[13]、病毒定量[14,15]、癌细胞基因微突变检测[16]、细胞因子基因定量[17]等，其结果都具有高特异性与高敏感性。
2. 分子信标: 是一种单链DNA形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端有一淬灭基团[18]，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两者之间发生荧光信号能量共振转移（fluorescent resonance energy transfer FRET），当热循环温度达到分子beacon的解链温度时，其构象发生改变，能与模板结合而完全伸展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号[19,20]。分子信标特别适用于检测点突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同DNA序列，而且其敏感性要远比同等长度的寡核苷酸探针高[21,22]，分子beacon已被用于
突变检测[23,24]、病原体定量[25,26]、病毒检测[27]和胚胎的性别判断[28]，它同时出用于多重PCR检测逆转录病毒[29]。
3. scorpions: 它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能[30]。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不能发射荧光。在反应的变性阶段，探针的发夹结构会解开，构象发生改变，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。同Taqman探针和分子beacon相比，scorpion能更快地发射出荧光且信号更为强烈[31]，其特异性也很高，因为只有在反应体系中存在特异的目的基因，探针-引物才会与之相结合。Scorpion是一种较新的荧光材料，具有良好的应用前景[31]。
4. 杂交探针：该材料使用四个寡聚核苷酸分子，两个引物与两个探针，杂交探针分别单标，一个携带荧光供体基团，一个携带荧光受体基团，当这两个探针杂交到目的基因上时，能形成首尾相连的结构使两个荧光基团相互靠近，发生FRET。受体基团能转移能量，使得供体基团在不同波长条件下被激发，发射出的荧光量直接与目的基因的产量成相关关系[32]。这一方法已被Roche公司生产的Lightcycler所应用，进行病原体检测[33]、病毒荷载量[34]的测定等领域。
5. SYBR Green I: 这是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光[35]。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，从经济角度考虑，它也比其它的探针的价格要便宜得多，但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性[36]。要避免这种不利因素，一方面可以通过Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等热循环仪内设定的程序过对扩增曲线进行分析，以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号，另一方面就是选择良好的引物和探针并优化反应条件以消除非特异性影响[37]。
实践中的问题：
实时定量PCR已广泛地运用于分子生物学的各个领域，就目前的应用情况来看，虽然取得了很好的效果，但是其在方法学上的选择、敏感性问题、重复性问题等都一直是争论不休的，本文将就这些问题做出探讨。
1. 方法的选择：研究者在实验中往往想要得到目的基因的绝对量，因为绝对定量对目的基因的表达差异有直接的反映[38]。绝对定量最为简单的方法就是标准曲线法，用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA[39]。目的基因与标准品在不同的反应管内同时进行扩增，使用的荧光材料可以是杂交探针、水解探针或是SYBR Green I。有研究表明[40]，这一方法的动力学范围可以达到9个数量级，远比终点法的要高。这一方法虽然简便，但是为了得到可靠的实验结果，有两个先决条件必须等到满足，一是所选用的标准品必须与目的基因的扩增效率一致，要达到这个要求，需要标准品同目的基因的同源性尽可能的高，不仅长度相似，而且其碱基组成也尽量相同；二是要尽可能地优化实验条件和模板的准备过程。就标准品而言，实践中有外参照和内参照之分，作为外参照的标准品与目的基因不在同一反应体系中进行扩增，所以它无法检测也不可能补偿可能出现在目的基因反应体系中的影响因素，如PCR抑制子[41]。事实上，在绝大多数的实验中，要想使标准品和目的基因的扩增效率完全一致是不可能的。为了弥补单独使用一个标准品作为外参照的不足，研究者便引入一个内参照同目的基因在同一反应体系中同时进行扩增，以反映体系中可能出现的PCR影响因素，此即所谓的竞争性PCR。竞争性PCR 所使用的内参照具有与目的基因序列相同的引物结合位点，但不具有相同的探针结合位点[42]。关于内参照的设计，有多种方法可供选择，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突变[43]，改变目的基因中的某些核苷酸[44]，设计不同的限制性酶识别位点[45]，也可以用非特异的间隔基因或间隔DNA 作为内参照[46]。竞争性PCR 设计的原理在于内参照与目的基因相互竞争反应的原料，所以两者的量应当相互匹配，如果一方的拷贝数大大的高于另一方，那么拷贝数多的一方就会在反应体系中得到优先扩增，而拷贝数少的一方则扩增受到抑制，定量也就不能有效地进行。由于使用了内对照，所以一旦体系中存在干扰PCR扩增的因素，就会通过内对照的扩增效率的变化反映出来，目前使用的实时定量PCR仪都是以扩增曲线上crossing point的漂移来体现扩增效率的变化的。竞争性PCR 由于能够消除反应体系中干扰因素的影响，所以它所等到的结果要准确可靠得多，但是由于在反应体系中同时扩增两种模板，使得其结果的测定范围比单使用外参要大为缩小，往往只有2-3个数量级[40]。正是由于竞争性PCR 有利有辟，所以研究者应根据不同的情况决定是否使用内参照。
在目前的研究中，大多数研究者选择使用绝对定量的方法，但是也有学者[47]认为在当前的条件下，绝对定量具有难以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀释浓度的标准品不仅费时费力，而且也有相当多的问题，目前广泛使用的在260nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。（2）标准品的稳定保存很难获得成功，高浓度的核酸物质易于被降解，而每次配制新的标准品又会增加批间差异。（3）每次测定样本都要同时测定标准品，而热循环仪的样本孔往往有限，所以使得不能在单批内测定更多的样本，这样也就使实时PCR 的高通量有所降低。（4）由于样本来源存在极大的差异，所以很难保证标准品与目的基因的扩增效率一致。这样会大大增加结果的变异，即使是各样本的DNA（或cDNA）有极小的差异或模板片断不均一，都会对定量的结果造成很大的差异。鉴于以上原因，这些学者强烈地推荐使用相对定量的方法，所谓相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷贝数的比较；（2）作为内源性对照补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程中造成的目的基因变异，以及反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素；（3）标准化标本[47]。由于管家基因在各种组织中是恒定表达的，所以可以以管家基因的定量来作为某种标准以比较样本来源不同的目的基因表达量的差异。通常选用的管家基因有GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根据具体的需要而选定合适的管家基因。使用的相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因的同管家基因的比值作为定量的最后结果。这一方法要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致。除了这种常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen[48]设计了一种比较阈值法来测定目的基因的相对表达，他们根据数学推导得出目的基因的量=2-^^Ct，在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)实验组-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)对照，所以，2-^^Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线，所以这一方法更为简便省时。统计学结果表明这一方法的结果也是相当可靠的。
总之，相对定量不仅比绝对定量更加简单，经济（如果不做标准曲线），而且也更为可靠和准确，因为存在于反应体系中的干扰因素，如样本不纯、试剂影响等都可以通过数学处理而去除。
2. 重复性问题：重复性是判断实验结果优劣的重要指标，其主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV）。对于特定的分析系统，重复性的高低决定了PCR反应能检测出样本中目的基因的初始浓度变化的最小值。由于PCR反应本身具有不精确扩增的特性，它所造成的结果精确性要远小于经典的临床化学检验和免疫分析。对于绝大多数实验，一般都可以计算出所设计体系能检测出样本初始浓度的最小值，根据多次实验可以求得该最小值的变异情况和它的可信区间范围，变异越小或是可信区间范围越小，说明这一反应体系的精确度越高。在实时定量PCR过程中，从样本的准备到扩增，再到定量的进行，实验中的每个方面都与实验的重复性息息相关，除了加样的准确性和实验所选用的仪器固定参数的限制之外，影响结果重复性较为关键的因素还包括（1）PCR 反应扩增的效率，如果在反应体系中扩增效率不一致，就会影响到目的基因在单位时间内的产量发生差异，从而影响到结果的稳定，要解决这个问题，必须尽量优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。（2）目的基因的初始浓度，初始拷贝数越低，结果的重复性越差，为了保证获得精确的结果，应使用初始浓度具有较高数量级的样本，如果待测样本中目的基因的量处于反应体系的检出限附近，那么最好是使用复孔以保证结果的可靠性。（3）标准曲线的影响，对于必须进行绝对定量的研究，标准曲线是必不可少的，虽然标准品和样本之间的差异始终存在，但是制作一个好的标准曲线对定量结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。
3. 敏感度问题：实时定量PCR 由于使用了荧光物质作为定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]报导实时定量PCR 的敏感性要高出传统的终点定量PCR 大约250倍。在理论上，只要设计的引物对目的基因有足够的特异性，PCR 应可检测出只含一个拷贝目的基因的样本，也的确有人报导在特定的反应条件下，实时定量PCR 可以检测出单细胞水平的基因组DNA[11]，但是在大多数情况下，对基因组DNA而言，它的最低检出限一般在pg到fg级，对于病毒、质粒而言，其检出限一般在102-103拷贝数以上[8]。影响实时定量PCR 敏感性的因素众多，除了对一般PCR反应均存在的影响因素如反应体系、Taq酶的活性之外,实时定量PCR还有其特殊的影响因素，包括：
(1)反应体系中形成的引物二聚体的影响：引物二聚体是非特异性退火和延伸的产物,它的形成不仅会影响到扩增的效率,而且由于SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合,所以会在反应体系中出现特异性产物与引物二聚体竞争SYBR Green I的现象,从而降低了实时PCR的敏感性。要解决这个问题，有多种方案可供选择，首先可以用水解探针代替SYBR Green I，虽然水解探针并不能消除引物二聚体的形成，但是在定量检测时，它却可以避开引物二聚体的干扰，专一地测定来自于特异产物的荧光信号，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用热启动办法，所谓热启动是指在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分，因为引物二聚体的是在各种试剂一经混合便开始形成的，所以用这种方法能有效地减少引物二聚体的形成，另外Lightcycler提供一种Taq酶的抗体，在PCR反应的最初阶段，这种抗体能阻断Taq酶的作用，但是当反应温度达到70度时，它便失活，使Taq酶开始发挥作用，在反应体系中加入这一抗体的目的也就是使要在反应达到较高温度时，才开始PCR扩增，从而避免反应初始阶段引物二聚体的形成。第三，要尽可能地优化引物设计，例如所设计的两条引物不能互补（尤其在3’端），使两条引物的GC含量大致一致，使用纯化的引物进行实验等，这些都是防止引物二聚体形成的根本因素。第四，如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。最后，在实验过程中应当注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。
（2）循环数：一般的实时定量PCR反应只须25－30个循环便可获得满意的结果，但是对于那些极微量的待测样本而言，适当增加循环数可以提高反应的检出限，有文献报导当循环数从25增加到34个循环时，实时定量PCR的最低检出限可从106增加到103。但是并非循环数增加得越多，其敏感性就会越高，实际上，当循环数增加到某一值时，敏感性便不再升高，因为循环数并不是影响敏感性的唯一因素，而且在实验过程中，也不可能因为增加敏感性而无限制地增加循环数，这不仅是实践中行不通，而且在理论上也不可行，因为随着循环数的增加，一方面，聚积的产物会抑制Taq酶的活性，另一方面，也会增加形成异源二聚体的可能性，这些都会影响到最终的定量结果。
（3）Mg2＋的浓度：根据Roche公司的Lightcycler3.5版本技术说明，Mg2+的浓度将影响到实时定量PCR的敏感性，其推荐使用的浓度为3mM。Mg2+浓度对敏感性的影响主要存在于两方面，首先，Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素，如果Mg2+的浓度无法达到使Taq酶发挥最佳活性，无疑将会影响到实时定量的敏感性；其次，Mg2+的浓度过高，会增加引物二聚体的形成，从而导致敏感性降低。所以在反应中选择合适的Mg2+浓度条件，是相当重要的。
实验方案优化：
由于各家公司生产的热循环仪提供的各种实验方案不太一致，所以优化的策略也不尽相同，然而在各种方案中，前文所述的那些影响实时PCR 反应的因素却总是相通的。只要能较好地控制实验条件，优化实验步骤，要想获得满意的实验结果并不一定都是困难的。下面本文将就影响到实验结果的一些基本参数和实验步骤谈一谈关于实时定量PCR的优化。
1. 基本参数的优化：
1.1 MgCl2的浓度 在PCR反应中，MgCl2的浓度对影响酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossing point)值，较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的深度选择应慎重。一般来说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择2－5mM浓度的MgCl2，对以mRNA为模板的RT－PCR而言，则应选择的浓度为4－8mM。
1.2 模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。一般而言，使Cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cp小于15则应选择较低的模板深度。对于Cp值的确定，经验上是SYBR Green I探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。
2. 使用SYBR Green I测定DNA时的条件优化：
2.1 MgCl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4 mM。
2.2模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。基因组DNA在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在10^6拷贝数左右选择。
2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的办法是将样本进行稀释，但是在某些条件下，抑制子的浓度高，而模板量少，稀释法就不再能达到好的效果，反会使反应的敏感度降低，所以，研究者若要进行实时定量PCR研究，最好选用纯化的模板。
2.4 引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，其浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，0.5uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.3－1.0uM之间进行选择，直至达到满意的结果。
2.6 退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃内进行选择。一般地，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有较大的差距。
3. 用SYBR Green I进行一步法RT－PCR的条件优化：
3.1 MgCl2的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4－8mM之间选择。
3.2模板的浓度：RT－PCR实验既可以选用总RNA，又可以选用mRNA，其浓度应在1pg-1ug之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的MS2或用alternative RNA 作为载体进行测定。
3.3对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。
4. 杂交探针测定DNA
4.1 MgCl2的浓度：在2－4mM的基础上加0.5－1.0mM，但是不要超过2.0mM。
4.2杂交探针的浓度：初次实验每个探针用0.2uM，如果信号强度达不到要求，可以增加至0.4uM。
4.3对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。每次实验都要设阳性对照。
4.4 其它的条件同SYBR Green I。
5 用杂交探针实时定量RT－PCR：
5.1 MgCl2的浓度：在4－8mM之间进行选择。
5.2杂交探针的浓度：初实验用0.2 uM，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。
5.3模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列知释度的实验，在条件有困难的条件下，至少要进行两个稀释度的测定。选用1pg-1ug的总RNA或是mRNA，若是模板的浓度过小（小于10ng/ul）,则可加入MS2或alternative RNA作为载体。
5.4 对照设置：每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。
6.关于杂交探针的评价：在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，致反应的效率下降。探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端完全磷酸化。
目前的实时定量PCR技术进展迅速，本文是结合本实验室的工作经验以及文献资料写成的，文中提到的一系列方案、实验材料和仪器设备都有其各自的优缺点，也有各自的使用范围，不能一概而论。所以不论研究者想进行何种研究，都应根据自己的情况首先找到适合自己研究目的的条件，本文仅供有意于运用实时定量PCR进行研究的人员参考。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具[1]。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测 荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量[2]。目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增[3,4,5]。本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。
实时定量PCR的应用现状
实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域[3]。
Giulietti 等人[6]对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法（如ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。
众所周知，cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。Rajeevan等人[7]利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。
实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究。例如Laird和他的同事们[8]建立了一种被称作Methylight的实时定量PCR方法，它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时PCR的敏感性和特异性，使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞[9]。又如Sevall等人[10]证明可以用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的杂交效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。
目前实时定量PCR在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上，这一技术对DNA和RNA病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册供人们使用，但是必须明确，国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技术[11]，它是一种利用电化学以光的等温PCR反应，在反应过程中能产生一种与靶RNA反极性的RNA扩增子，分子beacon常用于这种技术 ，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。
常用的热循环仪
对PCR产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种：
1. PE公司生产的Applied Biosystem系列：(1) ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链DNA结合染料、分子beacon原理的分析。一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要2小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析。(2) Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与 ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。(3) ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的仪器，其基本构成与ABI Prism 7700 SDS相同，但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96孔和384孔）。如果加上一个装载辅件，可以在24h之内完成84个384孔板的样本测定。
2. Roche 公司生产的Lightcycler热循环仪，它以能装载20-25ul的毛细硅管作为反应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光源对样本的影响。由二极管发射蓝光激发荧光，并提供三个滤光片，可利用荧光分光测定的原理，同时对一个反应体系的多种荧光进行检测，所以它完全可以进行多重PCR。由于Lightcycler使用了其独特毛细管反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化，从而能在20-30min内快速完成30-40循环，达到样本扩增的目的[12]。Lightcycler通常使用的实验材料主要是SYBRI Green I荧光染料和Taqman荧光探针和杂交探针。虽然Lightcycler有相当多的优点，但是这也有一些不足之处，由于它只提供一个32孔的样品盘，这使得不能在一次进行较多的样本测定。
3. Bio-rad 公司生产的iCycler iQ：这种仪器提供连续的检测波长调节，程序满足实时数据处理，可以同时在一个反应体系中检测四种荧光信号，由于一批能完成96个样本的测定，所以能提供相对较快的扩增反应。
4. Strategene公司的MX4000 Multiplex: 这种仪器的检测波长可在350-750nm范围内进行调节，以卤素灯作为激发光源，常选用的实验材料包括Taqman探针、杂交探针和分子信标（molecular beacon），其样品盘的规格有多处可供选择，包括96孔盘、8联管或单管，其程序也提供实时数据分析。
5. Cepheid公司的Smart Cycler System: 这种仪器正如其名一样具有强大的功能，它有16种反应模式可供选择，而且每种模式都有各自的程序，任一模式不仅能同时检测四种荧光信号，而且不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测。Smart Cycler System的这种设计虽然有其优点，但是其缺点也是显而易见的，由于其将样品盘分得过细，所以不利于同时进行较多样品的分析。
6. Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 这种仪器与Lightcycler相比，属于中心型热循环仪，即从反应体系内部进行热变化；其具有双光源系统，蓝光在470nm处激发荧光，绿光在530nm波长激发荧光；具有两种样品盘（32孔和72孔）供选择；可以对多种荧光材料进行测定 。
荧光材料新进展
为了满足实时PCR更高敏感性要求，各试剂公司都致力于开发新型的化学发光材料，目前作为商业用途的这些化学物质都能适用于上述的各种仪器。它们主要有以下几种：
1. 水解探针或Taqman探针：这种探针用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’à3’活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。常同探针5’端相结合的基团有FAM（6－羧基荧光素）,TET（四氯－6－羧基荧光素）,JOE（2，7－二甲基－4，5－二氯－6－羧基荧光素），HEX（六氯－6－甲基荧光素）或VIC，常与3’端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA (6- 羧基四甲基若丹明)或DABCYL（4-（4’-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）。相较之于TAMRA，使用DABCYL可以更有效的减少自发荧光信号[6]。目前，水解探针已被用于基因检测[13]、病毒定量[14,15]、癌细胞基因微突变检测[16]、细胞因子基因定量[17]等，其结果都具有高特异性与高敏感性。
2. 分子信标: 是一种单链DNA形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端有一淬灭基团[18]，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两者之间发生荧光信号能量共振转移（fluorescent resonance energy transfer FRET），当热循环温度达到分子beacon的解链温度时，其构象发生改变，能与模板结合而完全伸展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号[19,20]。分子信标特别适用于检测点突变，这能区分只有一个核苷酸差异的不同DNA序列，而且其敏感性要远比同等长度的寡核苷酸探针高[21,22]，分子beacon已被用于
突变检测[23,24]、病原体定量[25,26]、病毒检测[27]和胚胎的性别判断[28]，它同时出用于多重PCR检测逆转录病毒[29]。
3. scorpions: 它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能[30]。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不能发射荧光。在反应的变性阶段，探针的发夹结构会解开，构象发生改变，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。同Taqman探针和分子beacon相比，scorpion能更快地发射出荧光且信号更为强烈[31]，其特异性也很高，因为只有在反应体系中存在特异的目的基因，探针-引物才会与之相结合。Scorpion是一种较新的荧光材料，具有良好的应用前景[31]。
4. 杂交探针：该材料使用四个寡聚核苷酸分子，两个引物与两个探针，杂交探针分别单标，一个携带荧光供体基团，一个携带荧光受体基团，当这两个探针杂交到目的基因上时，能形成首尾相连的结构使两个荧光基团相互靠近，发生FRET。受体基团能转移能量，使得供体基团在不同波长条件下被激发，发射出的荧光量直接与目的基因的产量成相关关系[32]。这一方法已被Roche公司生产的Lightcycler所应用，进行病原体检测[33]、病毒荷载量[34]的测定等领域。
5. SYBR Green I: 这是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光[35]。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中，从经济角度考虑，它也比其它的探针的价格要便宜得多，但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性[36]。要避免这种不利因素，一方面可以通过Lightcycler和Rotor gene、Smart gene等热循环仪内设定的程序过对扩增曲线进行分析，以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号，另一方面就是选择良好的引物和探针并优化反应条件以消除非特异性影响[37]。
实践中的问题：
实时定量PCR已广泛地运用于分子生物学的各个领域，就目前的应用情况来看，虽然取得了很好的效果，但是其在方法学上的选择、敏感性问题、重复性问题等都一直是争论不休的，本文将就这些问题做出探讨。
1. 方法的选择：研究者在实验中往往想要得到目的基因的绝对量，因为绝对定量对目的基因的表达差异有直接的反映[38]。绝对定量最为简单的方法就是标准曲线法，用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。该标准品可以是纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA，或者是体外合成的ssDNA[39]。目的基因与标准品在不同的反应管内同时进行扩增，使用的荧光材料可以是杂交探针、水解探针或是SYBR Green I。有研究表明[40]，这一方法的动力学范围可以达到9个数量级，远比终点法的要高。这一方法虽然简便，但是为了得到可靠的实验结果，有两个先决条件必须等到满足，一是所选用的标准品必须与目的基因的扩增效率一致，要达到这个要求，需要标准品同目的基因的同源性尽可能的高，不仅长度相似，而且其碱基组成也尽量相同；二是要尽可能地优化实验条件和模板的准备过程。就标准品而言，实践中有外参照和内参照之分，作为外参照的标准品与目的基因不在同一反应体系中进行扩增，所以它无法检测也不可能补偿可能出现在目的基因反应体系中的影响因素，如PCR抑制子[41]。事实上，在绝大多数的实验中，要想使标准品和目的基因的扩增效率完全一致是不可能的。为了弥补单独使用一个标准品作为外参照的不足，研究者便引入一个内参照同目的基因在同一反应体系中同时进行扩增，以反映体系中可能出现的PCR影响因素，此即所谓的竞争性PCR。竞争性PCR 所使用的内参照具有与目的基因序列相同的引物结合位点，但不具有相同的探针结合位点[42]。关于内参照的设计，有多种方法可供选择，例如向目的基因序列中引入插入或缺失突变[43]，改变目的基因中的某些核苷酸[44]，设计不同的限制性酶识别位点[45]，也可以用非特异的间隔基因或间隔DNA 作为内参照[46]。竞争性PCR 设计的原理在于内参照与目的基因相互竞争反应的原料，所以两者的量应当相互匹配，如果一方的拷贝数大大的高于另一方，那么拷贝数多的一方就会在反应体系中得到优先扩增，而拷贝数少的一方则扩增受到抑制，定量也就不能有效地进行。由于使用了内对照，所以一旦体系中存在干扰PCR扩增的因素，就会通过内对照的扩增效率的变化反映出来，目前使用的实时定量PCR仪都是以扩增曲线上crossing point的漂移来体现扩增效率的变化的。竞争性PCR 由于能够消除反应体系中干扰因素的影响，所以它所等到的结果要准确可靠得多，但是由于在反应体系中同时扩增两种模板，使得其结果的测定范围比单使用外参要大为缩小，往往只有2-3个数量级[40]。正是由于竞争性PCR 有利有辟，所以研究者应根据不同的情况决定是否使用内参照。
在目前的研究中，大多数研究者选择使用绝对定量的方法，但是也有学者[47]认为在当前的条件下，绝对定量具有难以克服的缺陷，主要包括:(1)制作一系列稀释浓度的标准品不仅费时费力，而且也有相当多的问题，目前广泛使用的在260nm波长下定量的方法与众多因素有关，如水、缓冲液、仪器性能，乃至于核酸的抽提过程都会影响到结果的稳定性。（2）标准品的稳定保存很难获得成功，高浓度的核酸物质易于被降解，而每次配制新的标准品又会增加批间差异。（3）每次测定样本都要同时测定标准品，而热循环仪的样本孔往往有限，所以使得不能在单批内测定更多的样本，这样也就使实时PCR 的高通量有所降低。（4）由于样本来源存在极大的差异，所以很难保证标准品与目的基因的扩增效率一致。这样会大大增加结果的变异，即使是各样本的DNA（或cDNA）有极小的差异或模板片断不均一，都会对定量的结果造成很大的差异。鉴于以上原因，这些学者强烈地推荐使用相对定量的方法，所谓相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷贝数的比较；（2）作为内源性对照补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程中造成的目的基因变异，以及反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素；（3）标准化标本[47]。由于管家基因在各种组织中是恒定表达的，所以可以以管家基因的定量来作为某种标准以比较样本来源不同的目的基因表达量的差异。通常选用的管家基因有GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根据具体的需要而选定合适的管家基因。使用的相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因的同管家基因的比值作为定量的最后结果。这一方法要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致。除了这种常用的方法之外，最近Livak和Schmittgen[48]设计了一种比较阈值法来测定目的基因的相对表达，他们根据数学推导得出目的基因的量=2-^^Ct，在该公式中，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，ΔΔCt=(Ct,目的基因-Ct,管家基因)实验组-(Ct,目的基因-Ct,管家基因)对照，所以，2-^^Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线，所以这一方法更为简便省时。统计学结果表明这一方法的结果也是相当可靠的。
总之，相对定量不仅比绝对定量更加简单，经济（如果不做标准曲线），而且也更为可靠和准确，因为存在于反应体系中的干扰因素，如样本不纯、试剂影响等都可以通过数学处理而去除。
2. 重复性问题：重复性是判断实验结果优劣的重要指标，其主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV）。对于特定的分析系统，重复性的高低决定了PCR反应能检测出样本中目的基因的初始浓度变化的最小值。由于PCR反应本身具有不精确扩增的特性，它所造成的结果精确性要远小于经典的临床化学检验和免疫分析。对于绝大多数实验，一般都可以计算出所设计体系能检测出样本初始浓度的最小值，根据多次实验可以求得该最小值的变异情况和它的可信区间范围，变异越小或是可信区间范围越小，说明这一反应体系的精确度越高。在实时定量PCR过程中，从样本的准备到扩增，再到定量的进行，实验中的每个方面都与实验的重复性息息相关，除了加样的准确性和实验所选用的仪器固定参数的限制之外，影响结果重复性较为关键的因素还包括（1）PCR 反应扩增的效率，如果在反应体系中扩增效率不一致，就会影响到目的基因在单位时间内的产量发生差异，从而影响到结果的稳定，要解决这个问题，必须尽量优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率。（2）目的基因的初始浓度，初始拷贝数越低，结果的重复性越差，为了保证获得精确的结果，应使用初始浓度具有较高数量级的样本，如果待测样本中目的基因的量处于反应体系的检出限附近，那么最好是使用复孔以保证结果的可靠性。（3）标准曲线的影响，对于必须进行绝对定量的研究，标准曲线是必不可少的，虽然标准品和样本之间的差异始终存在，但是制作一个好的标准曲线对定量结果至关重要，在制作标准曲线时，应至少选择5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围，理想的标准品应与样本具有高同源性，最好是选择纯化的质粒DNA 或是体外合成、转录的RNA（用于RT-PCR），在制备过程中，应使用规范的步骤或是根据所购买的试剂盒提供的标准操作手册进行。
3. 敏感度问题：实时定量PCR 由于使用了荧光物质作为定量的工具，使得其敏感性又大大地提高了，有人[47]报导实时定量PCR 的敏感性要高出传统的终点定量PCR 大约250倍。在理论上，只要设计的引物对目的基因有足够的特异性，PCR 应可检测出只含一个拷贝目的基因的样本，也的确有人报导在特定的反应条件下，实时定量PCR 可以检测出单细胞水平的基因组DNA[11]，但是在大多数情况下，对基因组DNA而言，它的最低检出限一般在pg到fg级，对于病毒、质粒而言，其检出限一般在102-103拷贝数以上[8]。影响实时定量PCR 敏感性的因素众多，除了对一般PCR反应均存在的影响因素如反应体系、Taq酶的活性之外,实时定量PCR还有其特殊的影响因素，包括：
(1)反应体系中形成的引物二聚体的影响：引物二聚体是非特异性退火和延伸的产物,它的形成不仅会影响到扩增的效率,而且由于SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合,所以会在反应体系中出现特异性产物与引物二聚体竞争SYBR Green I的现象,从而降低了实时PCR的敏感性。要解决这个问题，有多种方案可供选择，首先可以用水解探针代替SYBR Green I，虽然水解探针并不能消除引物二聚体的形成，但是在定量检测时，它却可以避开引物二聚体的干扰，专一地测定来自于特异产物的荧光信号，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBR Green I高出10倍。其次，可以使用热启动办法，所谓热启动是指在反应体系达到引物退火温度时才加入某一反应成分，因为引物二聚体的是在各种试剂一经混合便开始形成的，所以用这种方法能有效地减少引物二聚体的形成，另外Lightcycler提供一种Taq酶的抗体，在PCR反应的最初阶段，这种抗体能阻断Taq酶的作用，但是当反应温度达到70度时，它便失活，使Taq酶开始发挥作用，在反应体系中加入这一抗体的目的也就是使要在反应达到较高温度时，才开始PCR扩增，从而避免反应初始阶段引物二聚体的形成。第三，要尽可能地优化引物设计，例如所设计的两条引物不能互补（尤其在3’端），使两条引物的GC含量大致一致，使用纯化的引物进行实验等，这些都是防止引物二聚体形成的根本因素。第四，如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。最后，在实验过程中应当注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。
（2）循环数：一般的实时定量PCR反应只须25－30个循环便可获得满意的结果，但是对于那些极微量的待测样本而言，适当增加循环数可以提高反应的检出限，有文献报导当循环数从25增加到34个循环时，实时定量PCR的最低检出限可从106增加到103。但是并非循环数增加得越多，其敏感性就会越高，实际上，当循环数增加到某一值时，敏感性便不再升高，因为循环数并不是影响敏感性的唯一因素，而且在实验过程中，也不可能因为增加敏感性而无限制地增加循环数，这不仅是实践中行不通，而且在理论上也不可行，因为随着循环数的增加，一方面，聚积的产物会抑制Taq酶的活性，另一方面，也会增加形成异源二聚体的可能性，这些都会影响到最终的定量结果。
（3）Mg2＋的浓度：根据Roche公司的Lightcycler3.5版本技术说明，Mg2+的浓度将影响到实时定量PCR的敏感性，其推荐使用的浓度为3mM。Mg2+浓度对敏感性的影响主要存在于两方面，首先，Mg2+是影响Taq酶活性的关键因素，如果Mg2+的浓度无法达到使Taq酶发挥最佳活性，无疑将会影响到实时定量的敏感性；其次，Mg2+的浓度过高，会增加引物二聚体的形成，从而导致敏感性降低。所以在反应中选择合适的Mg2+浓度条件，是相当重要的。
实验方案优化：
由于各家公司生产的热循环仪提供的各种实验方案不太一致，所以优化的策略也不尽相同，然而在各种方案中，前文所述的那些影响实时PCR 反应的因素却总是相通的。只要能较好地控制实验条件，优化实验步骤，要想获得满意的实验结果并不一定都是困难的。下面本文将就影响到实验结果的一些基本参数和实验步骤谈一谈关于实时定量PCR的优化。
1. 基本参数的优化：
1.1 MgCl2的浓度 在PCR反应中，MgCl2的浓度对影响酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossing point)值，较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的深度选择应慎重。一般来说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择2－5mM浓度的MgCl2，对以mRNA为模板的RT－PCR而言，则应选择的浓度为4－8mM。
1.2 模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。一般而言，使Cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cp小于15则应选择较低的模板深度。对于Cp值的确定，经验上是SYBR Green I探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。
2. 使用SYBR Green I测定DNA时的条件优化：
2.1 MgCl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4 mM。
2.2模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。基因组DNA在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在10^6拷贝数左右选择。
2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的办法是将样本进行稀释，但是在某些条件下，抑制子的浓度高，而模板量少，稀释法就不再能达到好的效果，反会使反应的敏感度降低，所以，研究者若要进行实时定量PCR研究，最好选用纯化的模板。
2.4 引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，其浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，0.5uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.3－1.0uM之间进行选择，直至达到满意的结果。
2.6 退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃内进行选择。一般地，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有较大的差距。
3. 用SYBR Green I进行一步法RT－PCR的条件优化：
3.1 MgCl2的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4－8mM之间选择。
3.2模板的浓度：RT－PCR实验既可以选用总RNA，又可以选用mRNA，其浓度应在1pg-1ug之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的MS2或用alternative RNA 作为载体进行测定。
3.3对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。
4. 杂交探针测定DNA
4.1 MgCl2的浓度：在2－4mM的基础上加0.5－1.0mM，但是不要超过2.0mM。
4.2杂交探针的浓度：初次实验每个探针用0.2uM，如果信号强度达不到要求，可以增加至0.4uM。
4.3对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。每次实验都要设阳性对照。
4.4 其它的条件同SYBR Green I。
5 用杂交探针实时定量RT－PCR：
5.1 MgCl2的浓度：在4－8mM之间进行选择。
5.2杂交探针的浓度：初实验用0.2 uM，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。
5.3模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列知释度的实验，在条件有困难的条件下，至少要进行两个稀释度的测定。选用1pg-1ug的总RNA或是mRNA，若是模板的浓度过小（小于10ng/ul）,则可加入MS2或alternative RNA作为载体。
5.4 对照设置：每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。
6.关于杂交探针的评价：在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3’末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，致反应的效率下降。探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端完全磷酸化。
目前的实时定量PCR技术进展迅速，本文是结合本实验室的工作经验以及文献资料写成的，文中提到的一系列方案、实验材料和仪器设备都有其各自的优缺点，也有各自的使用范围，不能一概而论。所以不论研究者想进行何种研究，都应根据自己的情况首先找到适合自己研究目的的条件，本文仅供有意于运用实时定量PCR进行研究的人员参考。
