材料与仪器
MgCl2 探针 HotStmMix 正向和反向扩增引物 模板 DNA
PCR 仪 反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板
PCR 仪 反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
MgCl2(25 mmol/L)
探针（例如分子信号）或 SYBRGreen(MolecularProbes)
2. 酶和酶缓冲液
HotStmMix，2X(含有 TaqDNA 聚合酶、PCR 缓冲液和 dNTP)
3. 核酸和寡核苷酸
正向和反向扩增引物
模板 DNA
4. 专用设备
实时 PCR 仪
合适的反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板（按照不同的方法选用）
二、方法 A----ABI7700ORI-CYCLER
1.在 96 孔的微量滴定板上为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。
2XHotStartMix 25ul
引物 A 0.1~ 0.5umol/L
引物 B 0.1~ 0.5umol/L
探针或 SYBRGreen 0.1~ 0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 10ul
水 补满到 50ul
2.使用两步（所有的 ABI7700TaqMan 定量分析）或三步 PCR。对于三步 PCR, 利用如下条件运行 40~50 个循环进行扩增。
对于两步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火温度到 60°C。
~undefined取决于 HotStart 程序。
3.继续进行下文步骤④的优化方案。
三、方法 B—SMARTCYCLER
1.在适当的管中为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen, 按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。
2XHotStartMix 2.5ul
引物 A 0.3~0.8umol/L
引物 B 0.3~0.8umol/L
探针或 SYBRGreen 0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 5ul
水 补满到 25ul
Smartcycler 要求使用专用的管子。
2.利用两步或三步 PCR。对于三步 PCR，利用如下条件运行 40 个循环进行扩增。
对于两步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火温度到 60°C。
~undefined取决于 HotStart 程序。
3.继续进行下文步骤4的优化方案。
四、方法 C-----LIGHTCYCLERPCR
1.在适当的管中为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。
2XFastStartMix 10ul
引物 A 0.1~0.5umol/L
引物 B 0.1~0.5umol/L
探针或 SYBRGreeundefined 0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 5ul
水 补满到 20ul
~undefinedLightCycler 要求使用毛细管。
2.利用三步 PCR, 如下条件运行 40(原文为 45—译者改）个循环进行扩增。
3.继续进行下文步骤④的优化方案。
优化定置分析的实用方法（见 InnisandGelfand1990;HarrisandJones1997)
4.为了优化扩增子和引物，利用解链曲线功能分析实时 PCR 产物，此功能在 ABI770上不能直接获得。对单个产物而言，结果应显示其具有一个特异的解链峰，没有表明形成引物二聚体的次级烽。当解链曲线数据以一阶导数表示时将会是一单峰。多个峰表明有其他的扩增产物存在。如果检测到多个峰，说明可能需要进一步优化镁离子的浓度，但通常这表明需要重新设计引物。
5.为了优化探针，可利用靶分子的 1 倍稀释液，选择任意单位作标准曲线。例如假定DNA 的最高浓度值是 107，由此它的 10 倍稀释系列分别定为 107、106、105、104、103。鍵入这些数值作为起始量，在定量分析结束时用软件作标准曲线。利用循环阈（Ct) 值和DNA 的起始浓度将可计算反应效率。
6.与常规 PCR 相似，需用一系列按 10 倍稀释的标准液做进一步反应，以优化 MgCl2的浓度、引物浓度、探针浓度、退火温度，以及调整 PCR 方案。
7.对于本身没有快速循环操作方案的体系，可以尝试进行更短的循环方案，以减少定量分析的时间。
1. 缓冲液和溶液
MgCl2(25 mmol/L)
探针（例如分子信号）或 SYBRGreen(MolecularProbes)
2. 酶和酶缓冲液
HotStmMix，2X(含有 TaqDNA 聚合酶、PCR 缓冲液和 dNTP)
3. 核酸和寡核苷酸
正向和反向扩增引物
模板 DNA
4. 专用设备
实时 PCR 仪
合适的反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板（按照不同的方法选用）
二、方法 A----ABI7700ORI-CYCLER
1.在 96 孔的微量滴定板上为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。
2XHotStartMix 25ul
引物 A 0.1~ 0.5umol/L
引物 B 0.1~ 0.5umol/L
探针或 SYBRGreen 0.1~ 0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 10ul
水 补满到 50ul
2.使用两步（所有的 ABI7700TaqMan 定量分析）或三步 PCR。对于三步 PCR, 利用如下条件运行 40~50 个循环进行扩增。
对于两步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火温度到 60°C。
~undefined取决于 HotStart 程序。
3.继续进行下文步骤④的优化方案。
三、方法 B—SMARTCYCLER
1.在适当的管中为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen, 按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。
2XHotStartMix 2.5ul
引物 A 0.3~0.8umol/L
引物 B 0.3~0.8umol/L
探针或 SYBRGreen 0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 5ul
水 补满到 25ul
Smartcycler 要求使用专用的管子。
2.利用两步或三步 PCR。对于三步 PCR，利用如下条件运行 40 个循环进行扩增。
对于两步 PCR，省去 72°C 延伸，增加退火温度到 60°C。
~undefined取决于 HotStart 程序。
3.继续进行下文步骤4的优化方案。
四、方法 C-----LIGHTCYCLERPCR
1.在适当的管中为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen，按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。
2XFastStartMix 10ul
引物 A 0.1~0.5umol/L
引物 B 0.1~0.5umol/L
探针或 SYBRGreeundefined 0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L) 3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg) 5ul
水 补满到 20ul
~undefinedLightCycler 要求使用毛细管。
2.利用三步 PCR, 如下条件运行 40(原文为 45—译者改）个循环进行扩增。
3.继续进行下文步骤④的优化方案。
优化定置分析的实用方法（见 InnisandGelfand1990;HarrisandJones1997)
4.为了优化扩增子和引物，利用解链曲线功能分析实时 PCR 产物，此功能在 ABI770上不能直接获得。对单个产物而言，结果应显示其具有一个特异的解链峰，没有表明形成引物二聚体的次级烽。当解链曲线数据以一阶导数表示时将会是一单峰。多个峰表明有其他的扩增产物存在。如果检测到多个峰，说明可能需要进一步优化镁离子的浓度，但通常这表明需要重新设计引物。
5.为了优化探针，可利用靶分子的 1 倍稀释液，选择任意单位作标准曲线。例如假定DNA 的最高浓度值是 107，由此它的 10 倍稀释系列分别定为 107、106、105、104、103。鍵入这些数值作为起始量，在定量分析结束时用软件作标准曲线。利用循环阈（Ct) 值和DNA 的起始浓度将可计算反应效率。
6.与常规 PCR 相似，需用一系列按 10 倍稀释的标准液做进一步反应，以优化 MgCl2的浓度、引物浓度、探针浓度、退火温度，以及调整 PCR 方案。
7.对于本身没有快速循环操作方案的体系，可以尝试进行更短的循环方案，以减少定量分析的时间。
来源：丁香实验
