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核酸吸光度、分子量、摩尔浓度之间的相互换算及引物浓度的确定

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光度计测量的转换:

双链DNA (ds DNA):A260 = OD260 = 1 相当于50 µg/ml溶液

单链DNA(ss DNA):A260 = OD260 = 1相当于33 µg/ml溶液

RNA:A260 = OD260 = 1相当于40 µg/ml溶液

参考文献:Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.

核酸分子量计算方程式:

吸光度(A)=摩尔消光系数×浓度×长度

500 bp的双链DNA=325,000 Daltons

500 nundefined的单链DNA=162,500 Daltons *nt = nucleotide

dNMP的平均分子量=325 Daltons

寡聚体定量:

20-mer,A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体:5 nmol = 33 µg/(20×325)

40-mer,A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体:2.5 nmol = 33 µg/(40×325)

pmol为单位的引物转换为µg为单位的引物:

(X pmoles×长度bp×325)/ 1,000,000

例:10pmoles的25-mer,则为

(10pmol×25bp×325)/ 1,000,000 = 0.081 µg primer

µg为单位的引物转换为pmol为单位的引物:

(X pmoles×1,000,000)/(长度bp ×325)

例:0.1µg的20-mer,则为

(0.1µg×1,000,000)/(20bp×325)= 15.4 pmoles primer

PCR扩增反应引物浓度的计算:

引物毫摩尔浓度(mM)= pmoles/µl

例1:100µl PCR反应体系中有20pmol的引物 = 0.20 mM

例2:引物为24bp,并溶解于0.1ml µl H2O中;

10µl溶液稀释至1.0ml测定其A260为:A260 = OD260 = 0.76;

则贮存液在260nm(A260)的吸光度为76;

0.1ml的贮存液含有7.6个单位的A260;

引物碱基组成为:A=6, C=6, G=6, T=6;

260nm引物的摩尔消光系数 = a(16,000) + b(12,000) + c(7,000) + d(9,600)

注:a、b、c、d分别是 A's、G's、C's、T's的碱基个数;

PCR引物的摩尔消光系数= 6(16,000) + 6(12,000) + 6(7,000) + 6(9,600) = 267,600

则PCR引物贮存液的摩尔浓度为:76/267,600 = 284 mM

引物浓度的确定
一般合成的寡聚体DNA(Oligo DNA)均以OD260来单位来表示的。所谓OD260值是指在1ml体积1cm光径标准比色杯中,260nm波长下吸光度为1 A260的寡聚体DNA溶液被定义为1 OD260。因此,根据此定义,1OD260单位相当于33ug的寡聚体DNA,从而可根据寡聚体DNA的OD260值及其自身分子量来计算得到摩尔数,以计算不同浓度的溶液。

1.寡聚体DNA分子量(MW)的精确算法:

一般而言,寡聚体DNA的精确分子量可根据下述公式进行计算:

MW=(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)- 61

例:TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG
A=1 C=3 G=11 T=6
MW =(1×312)+(3×288)+(11×328)+(6×303)- 61 = 6541

2.寡聚体DNA分子量(MW)的粗略算法:

由于寡聚体DNA中的每个脱氧核苷酸的平均分子量近似于324.5,因此,一条寡聚体DNA的分子量粗略算法为:

MW = 碱基数bp×324.5

粗略算法示例:

1 OD260 的20-mer Oligo DNA,则
分子量 = 20×324.5 = 6490
质量数 = 1×33 = 33ug
摩尔数 = 33/6490 = 0.005umol = 5nmol

3.寡聚体DNA摩尔数的粗略算法:

即1个OD260值的X-mer Oligo DNA摩尔数计算公式为:
Y nmol = 33ug ÷(Xbp×324.5)
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