核酸吸光度、分子量、摩尔浓度之间的相互换算及引物浓度的确定
丁香园
9415
光度计测量的转换:
双链DNA (ds DNA)：A260 = OD260 = 1 相当于50 µg/ml溶液
单链DNA(ss DNA)：A260 = OD260 = 1相当于33 µg/ml溶液
RNA：A260 = OD260 = 1相当于40 µg/ml溶液
参考文献：Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.
核酸分子量计算方程式：
吸光度(A)＝摩尔消光系数×浓度×长度
500 bp的双链DNA＝325,000 Daltons
500 nundefined的单链DNA＝162,500 Daltons *nt = nucleotide
dNMP的平均分子量＝325 Daltons
寡聚体定量：
20-mer，A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体：5 nmol = 33 µg/(20×325)
40-mer，A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体：2.5 nmol = 33 µg/(40×325)
pmol为单位的引物转换为µg为单位的引物：
（X pmoles×长度bp×325）/ 1,000,000
例：10pmoles的25-mer，则为
（10pmol×25bp×325）/ 1,000,000 = 0.081 µg primer
µg为单位的引物转换为pmol为单位的引物：
（X pmoles×1,000,000）/（长度bp ×325）
例：0.1µg的20-mer，则为
（0.1µg×1,000,000）/（20bp×325）= 15.4 pmoles primer
PCR扩增反应引物浓度的计算：
引物毫摩尔浓度（mM）= pmoles/µl
例1：100µl PCR反应体系中有20pmol的引物 = 0.20 mM
例2：引物为24bp，并溶解于0.1ml µl H2O中；
10µl溶液稀释至1.0ml测定其A260为：A260 = OD260 = 0.76；
则贮存液在260nm（A260）的吸光度为76；
0.1ml的贮存液含有7.6个单位的A260；
引物碱基组成为：A=6, C=6, G=6, T=6；
260nm引物的摩尔消光系数 = a(16,000) + b(12,000) + c(7,000) + d(9,600)
注：a、b、c、d分别是 A's、G's、C's、T's的碱基个数；
PCR引物的摩尔消光系数= 6(16,000) + 6(12,000) + 6(7,000) + 6(9,600) = 267,600
则PCR引物贮存液的摩尔浓度为：76/267,600 = 284 mM
引物浓度的确定
一般合成的寡聚体DNA（Oligo DNA）均以OD260来单位来表示的。所谓OD260值是指在1ml体积1cm光径标准比色杯中，260nm波长下吸光度为1 A260的寡聚体DNA溶液被定义为1 OD260。因此，根据此定义，1OD260单位相当于33ug的寡聚体DNA，从而可根据寡聚体DNA的OD260值及其自身分子量来计算得到摩尔数，以计算不同浓度的溶液。
1.寡聚体DNA分子量（MW）的精确算法：
一般而言，寡聚体DNA的精确分子量可根据下述公式进行计算：
MW＝（A碱基数×312）＋（C碱基数×288）＋（G碱基数×328）＋（T碱基数×303）－ 61
例：TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG
A=1 C=3 G=11 T=6
MW ＝（1×312）＋（3×288）＋（11×328）＋（6×303）－ 61 ＝ 6541
2.寡聚体DNA分子量（MW）的粗略算法：
由于寡聚体DNA中的每个脱氧核苷酸的平均分子量近似于324.5，因此，一条寡聚体DNA的分子量粗略算法为：
MW ＝ 碱基数bp×324.5
粗略算法示例：
1 OD260 的20-mer Oligo DNA，则
分子量 ＝ 20×324.5 ＝ 6490
质量数 ＝ 1×33 ＝ 33ug
摩尔数 ＝ 33/6490 ＝ 0.005umol ＝ 5nmol
3.寡聚体DNA摩尔数的粗略算法：
即1个OD260值的X-mer Oligo DNA摩尔数计算公式为：
Y nmol ＝ 33ug ÷（Xbp×324.5）
双链DNA (ds DNA)：A260 = OD260 = 1 相当于50 µg/ml溶液
单链DNA(ss DNA)：A260 = OD260 = 1相当于33 µg/ml溶液
RNA：A260 = OD260 = 1相当于40 µg/ml溶液
参考文献：Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.
核酸分子量计算方程式：
吸光度(A)＝摩尔消光系数×浓度×长度
500 bp的双链DNA＝325,000 Daltons
500 nundefined的单链DNA＝162,500 Daltons *nt = nucleotide
dNMP的平均分子量＝325 Daltons
寡聚体定量：
20-mer，A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体：5 nmol = 33 µg/(20×325)
40-mer，A260 = 1的贮存液含有5 nmol寡聚体：2.5 nmol = 33 µg/(40×325)
pmol为单位的引物转换为µg为单位的引物：
（X pmoles×长度bp×325）/ 1,000,000
例：10pmoles的25-mer，则为
（10pmol×25bp×325）/ 1,000,000 = 0.081 µg primer
µg为单位的引物转换为pmol为单位的引物：
（X pmoles×1,000,000）/（长度bp ×325）
例：0.1µg的20-mer，则为
（0.1µg×1,000,000）/（20bp×325）= 15.4 pmoles primer
PCR扩增反应引物浓度的计算：
引物毫摩尔浓度（mM）= pmoles/µl
例1：100µl PCR反应体系中有20pmol的引物 = 0.20 mM
例2：引物为24bp，并溶解于0.1ml µl H2O中；
10µl溶液稀释至1.0ml测定其A260为：A260 = OD260 = 0.76；
则贮存液在260nm（A260）的吸光度为76；
0.1ml的贮存液含有7.6个单位的A260；
引物碱基组成为：A=6, C=6, G=6, T=6；
260nm引物的摩尔消光系数 = a(16,000) + b(12,000) + c(7,000) + d(9,600)
注：a、b、c、d分别是 A's、G's、C's、T's的碱基个数；
PCR引物的摩尔消光系数= 6(16,000) + 6(12,000) + 6(7,000) + 6(9,600) = 267,600
则PCR引物贮存液的摩尔浓度为：76/267,600 = 284 mM
引物浓度的确定
一般合成的寡聚体DNA（Oligo DNA）均以OD260来单位来表示的。所谓OD260值是指在1ml体积1cm光径标准比色杯中，260nm波长下吸光度为1 A260的寡聚体DNA溶液被定义为1 OD260。因此，根据此定义，1OD260单位相当于33ug的寡聚体DNA，从而可根据寡聚体DNA的OD260值及其自身分子量来计算得到摩尔数，以计算不同浓度的溶液。
1.寡聚体DNA分子量（MW）的精确算法：
一般而言，寡聚体DNA的精确分子量可根据下述公式进行计算：
MW＝（A碱基数×312）＋（C碱基数×288）＋（G碱基数×328）＋（T碱基数×303）－ 61
例：TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG
A=1 C=3 G=11 T=6
MW ＝（1×312）＋（3×288）＋（11×328）＋（6×303）－ 61 ＝ 6541
2.寡聚体DNA分子量（MW）的粗略算法：
由于寡聚体DNA中的每个脱氧核苷酸的平均分子量近似于324.5，因此，一条寡聚体DNA的分子量粗略算法为：
MW ＝ 碱基数bp×324.5
粗略算法示例：
1 OD260 的20-mer Oligo DNA，则
分子量 ＝ 20×324.5 ＝ 6490
质量数 ＝ 1×33 ＝ 33ug
摩尔数 ＝ 33/6490 ＝ 0.005umol ＝ 5nmol
3.寡聚体DNA摩尔数的粗略算法：
即1个OD260值的X-mer Oligo DNA摩尔数计算公式为：
Y nmol ＝ 33ug ÷（Xbp×324.5）
