<讨论>使用标准曲线来判定扩增效率的谬误！
丁香园论坛
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jiangjun82313 wrote:
发表一点不同看法:
1. 相对定量还是有相当市场的, 大家看文献即可知道.
2. 相对定量(2-2deltCt法)需要验证扩增效率, 且扩增效率接近100%. 在你提到的哪篇文章里有: (1+E)-△△CT, 2 -△△CT是当二者的扩增效率接近1时才能得到.
3. 选择一个组织的检验扩增效率就可以, 因为扩增效率主要与PCR条件有关.
4. 是每个组织都要做三个重复,然后取平均值,然后再在一组小鼠的相同组织中取平均值和内参基因相减. 可以分开管扩增(内参基因和目的基因单独扩增,用SYBR One只能如此.) 用探针可以在同管, 但是会麻烦(条件难摸).
5. 目的基因和内参基因转入细菌质粒里,然后抽提,以这个为模板梯度稀释做标准曲线,看二者斜率是否一致,然后判断扩增效率是否一致,这种方法有依据.
有Paper这样做, 还有的用PCR产物为模板梯度稀释做标准曲线. 个人认为用质粒为模板梯度稀释做标准曲线比较方便.
质粒稳定, 易得,浓度高, 纯度高. 做标准曲线一般10X或5X稀释最少4-5个梯度才能做标准曲线, cDNA很难有如此高的浓度, 而PCR产物做的不好(我试过, 可能杂质影响)
5. 扩增效率可以根据标准曲线计算.
浓度梯度的log值对Ct作图(Y:浓度梯度的log值, X: Ct)
E=10(-K)次方-1, K为标准曲线的斜率
目的基因和内参基因的扩增效率接近100% 即可(95%-105%), 这样更方便, 好操作
我用的也是相对定量方法, 特与大家探讨.
看到这样的说法，让我知道标准曲线这种思想对于大家的谬误影响有多深。我必须指出这里的问题，供大家参考：
1、扩增效率大小：
“目的基因和内参基因的扩增效率接近100% 即可(95%-105%)”，PCR扩增是DNA拷贝以一种近似2的倍数的方式进行，其最大基数为2，如果扩增效率无法达到的话，基数只会小于2，我无法想象一个基数大于2的PCR是怎么进行的。所以扩增效率大于100％也是无法想象的。
2、扩增效率的判定：
一个pcr实验过程的扩增效率的判定，按照楼上所说，是用“E=10(-K)次方-1, K为标准曲线的斜率”这个公式来判定，那么其实质就是看每一个稀释梯度和delta ct的比值（就是标准曲线的斜率），所以大家可以想想看，这个比值真的是和扩增效率有关吗？不是的，它只是和实验者的梯度稀释操作的水平相关。因为模板每相差一个数量级（10倍），其delta ct都约＝3.01（1undefinedlog2），根据稀释水平的差异，各个稀释梯度的delta ct有不同的差别，这就给后面的拟合曲线带来了使某些拟合的曲线的斜率是的公式中的E超过100％的可能性。这显然是非常不科学的。
至于扩增效率的判定方法，http://www.transhold.net/services.htm 《Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics》 这篇文献有非常详细的说明，希望战友们看看，就会明白的。
3、扩增效率对定量PCR实验研究的影响
通过上面的说明，也就是说这个标准曲线斜率求算扩增效率的方法是风马牛不相及的事情，那么我们怎么使用定量PCR技术来研究基因表达呢？这里我还是重复我上面讲的话，在这个实验过程中，除去认为造成的不一致因素之外，其他的因素可以作为系统误差来看待而忽略。
留个msn方便交流：transhold@transhold.net QQ技术讨论群：13893727
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1. 相对定量还是有相当市场的, 大家看文献即可知道.
2. 相对定量(2-2deltCt法)需要验证扩增效率, 且扩增效率接近100%. 在你提到的哪篇文章里有: (1+E)-△△CT, 2 -△△CT是当二者的扩增效率接近1时才能得到.
3. 选择一个组织的检验扩增效率就可以, 因为扩增效率主要与PCR条件有关.
4. 是每个组织都要做三个重复,然后取平均值,然后再在一组小鼠的相同组织中取平均值和内参基因相减. 可以分开管扩增(内参基因和目的基因单独扩增,用SYBR One只能如此.) 用探针可以在同管, 但是会麻烦(条件难摸).
5. 目的基因和内参基因转入细菌质粒里,然后抽提,以这个为模板梯度稀释做标准曲线,看二者斜率是否一致,然后判断扩增效率是否一致,这种方法有依据.
有Paper这样做, 还有的用PCR产物为模板梯度稀释做标准曲线. 个人认为用质粒为模板梯度稀释做标准曲线比较方便.
质粒稳定, 易得,浓度高, 纯度高. 做标准曲线一般10X或5X稀释最少4-5个梯度才能做标准曲线, cDNA很难有如此高的浓度, 而PCR产物做的不好(我试过, 可能杂质影响)
5. 扩增效率可以根据标准曲线计算.
浓度梯度的log值对Ct作图(Y:浓度梯度的log值, X: Ct)
E=10(-K)次方-1, K为标准曲线的斜率
目的基因和内参基因的扩增效率接近100% 即可(95%-105%), 这样更方便, 好操作
我用的也是相对定量方法, 特与大家探讨.
看到这样的说法，让我知道标准曲线这种思想对于大家的谬误影响有多深。我必须指出这里的问题，供大家参考：
1、扩增效率大小：
“目的基因和内参基因的扩增效率接近100% 即可(95%-105%)”，PCR扩增是DNA拷贝以一种近似2的倍数的方式进行，其最大基数为2，如果扩增效率无法达到的话，基数只会小于2，我无法想象一个基数大于2的PCR是怎么进行的。所以扩增效率大于100％也是无法想象的。
2、扩增效率的判定：
一个pcr实验过程的扩增效率的判定，按照楼上所说，是用“E=10(-K)次方-1, K为标准曲线的斜率”这个公式来判定，那么其实质就是看每一个稀释梯度和delta ct的比值（就是标准曲线的斜率），所以大家可以想想看，这个比值真的是和扩增效率有关吗？不是的，它只是和实验者的梯度稀释操作的水平相关。因为模板每相差一个数量级（10倍），其delta ct都约＝3.01（1undefinedlog2），根据稀释水平的差异，各个稀释梯度的delta ct有不同的差别，这就给后面的拟合曲线带来了使某些拟合的曲线的斜率是的公式中的E超过100％的可能性。这显然是非常不科学的。
至于扩增效率的判定方法，http://www.transhold.net/services.htm 《Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics》 这篇文献有非常详细的说明，希望战友们看看，就会明白的。
3、扩增效率对定量PCR实验研究的影响
通过上面的说明，也就是说这个标准曲线斜率求算扩增效率的方法是风马牛不相及的事情，那么我们怎么使用定量PCR技术来研究基因表达呢？这里我还是重复我上面讲的话，在这个实验过程中，除去认为造成的不一致因素之外，其他的因素可以作为系统误差来看待而忽略。
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