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[原创]亚硫酸氢盐修饰DNA步骤<<DNA methylation>>译稿

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亚硫酸氢盐修饰DNA步骤
一、内切酶作用体系:(自建立,试过,效果很好)
EcoRⅠ TaKaRa 消化DNA 37℃ 3h
ddH2O 11ul
H溶液 2ul
EcoRⅠ 1ul
DNA 6ul
37℃ 孵育 3h
二、亚硫酸氢盐修饰过程:(翻译稿)
1.  用适合的内切酶消化大分子量的DNA(避免目的基因被切割),或者通过把DNA悬于蛋白酶k/SDS缓冲液,通过26 gauge needle 5次,37℃孵育30min(降低DNA大小,利于充分变性)
2.  加2.2ul新鲜配制的3M NaOH 到18ul DNA样品中,搅拌混匀,短暂离心。
3.  37℃孵育15min。(有的资料介绍说可以42度 20min)
4.  90℃孵育2min(95度5nin也可),置于冰上,短暂离心。
5.  加208 ul 饱和的 Na2S2O5 PH 5.0(BDH)。(加7.6g Na2S2O5 到15ml 水,加464ul 新鲜配制的10 M NaOH)
6.  加12ul 10mM 氢醌(55mg加水50ml氢醌),混匀并短暂离心
7.  加200 ul 矿物油,防止水分蒸发,限制氧化。
8.  55℃孵育4-16h(水浴)。
9.  吸弃上层矿物油。
10.  ①加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin 按照指导书进行脱盐处理。每个管与2.5ml注射器相连,(注意连接紧)用吸管吸到注射器,底加2ml的离心管;轻轻加压,不 要弄破膜;②加2ml 80%的异丙醇洗涤,离心10000rpm,30s,底换管;柱子换到新1.5ml尖EP管,弃注射器;③加50ul预热水(60-70℃)放2-3min;离心(柱子与离心管一起,10000rpm,30s,DNA到EP管,弃柱子;
11.  加50ul 水到minicolumn 室温下静置5min
12.  离心20s 收积洗提液,弃掉minicolumn
13.  加5.5ul 3M NaOH 然后 37℃ 孵育15 min
14.  短暂离心
15.  加 1ul 糖原(10mg/ml)
16.  加33.3ul 5M NH4OAcetate PH 7.0
17.  加330ul 冷(-20℃)100%乙醇,充分混匀
18.  -20℃过夜(或者-70℃ 30min)
19.  4℃ 下14000 rpm 离心15min
20.  弃上清,加70%乙醇洗涤,4℃ 下14000 rpm 离心15min。
21.  重悬DNA于10ul 水中,室温下静置~2h,间隔旋涡振荡
22.  -20℃保存DNA
hotstar 酶做PCR,或者做Q-PCR
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