[原创]亚硫酸氢盐修饰DNA步骤<<DNA methylation>>译稿
丁香园
901
亚硫酸氢盐修饰DNA步骤
一、内切酶作用体系：（自建立，试过，效果很好）
EcoRⅠ TaKaRa 消化DNA 37℃ 3h
ddH2O 11ul
H溶液 2ul
EcoRⅠ 1ul
DNA 6ul
37℃ 孵育 3h
二、亚硫酸氢盐修饰过程：（翻译稿）
1. 用适合的内切酶消化大分子量的DNA（避免目的基因被切割），或者通过把DNA悬于蛋白酶k/SDS缓冲液，通过26 gauge needle 5次，37℃孵育30min（降低DNA大小，利于充分变性）
2. 加2.2ul新鲜配制的3M NaOH 到18ul DNA样品中，搅拌混匀，短暂离心。
3. 37℃孵育15min。（有的资料介绍说可以42度 20min）
4. 90℃孵育2min（95度5nin也可），置于冰上，短暂离心。
5. 加208 ul 饱和的 Na2S2O5 PH 5.0（BDH）。（加7.6g Na2S2O5 到15ml 水，加464ul 新鲜配制的10 M NaOH）
6. 加12ul 10mM 氢醌（55mg加水50ml氢醌），混匀并短暂离心
7. 加200 ul 矿物油，防止水分蒸发，限制氧化。
8. 55℃孵育4-16h（水浴）。
9. 吸弃上层矿物油。
10. ①加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin 按照指导书进行脱盐处理。每个管与2.5ml注射器相连，（注意连接紧）用吸管吸到注射器，底加2ml的离心管；轻轻加压，不 要弄破膜；②加2ml 80％的异丙醇洗涤，离心10000rpm，30s，底换管；柱子换到新1.5ml尖EP管，弃注射器；③加50ul预热水（60-70℃）放2-3min；离心（柱子与离心管一起，10000rpm，30s，DNA到EP管，弃柱子；
11. 加50ul 水到minicolumn 室温下静置5min
12. 离心20s 收积洗提液，弃掉minicolumn
13. 加5.5ul 3M NaOH 然后 37℃ 孵育15 min
14. 短暂离心
15. 加 1ul 糖原（10mg/ml）
16. 加33.3ul 5M NH4OAcetate PH 7.0
17. 加330ul 冷（-20℃）100％乙醇，充分混匀
18. －20℃过夜（或者－70℃ 30min）
19. 4℃ 下14000 rpm 离心15min
20. 弃上清，加70％乙醇洗涤，4℃ 下14000 rpm 离心15min。
21. 重悬DNA于10ul 水中，室温下静置～2h，间隔旋涡振荡
22. －20℃保存DNA
hotstar 酶做PCR，或者做Q-PCR
一、内切酶作用体系：（自建立，试过，效果很好）
EcoRⅠ TaKaRa 消化DNA 37℃ 3h
ddH2O 11ul
H溶液 2ul
EcoRⅠ 1ul
DNA 6ul
37℃ 孵育 3h
二、亚硫酸氢盐修饰过程：（翻译稿）
1. 用适合的内切酶消化大分子量的DNA（避免目的基因被切割），或者通过把DNA悬于蛋白酶k/SDS缓冲液，通过26 gauge needle 5次，37℃孵育30min（降低DNA大小，利于充分变性）
2. 加2.2ul新鲜配制的3M NaOH 到18ul DNA样品中，搅拌混匀，短暂离心。
3. 37℃孵育15min。（有的资料介绍说可以42度 20min）
4. 90℃孵育2min（95度5nin也可），置于冰上，短暂离心。
5. 加208 ul 饱和的 Na2S2O5 PH 5.0（BDH）。（加7.6g Na2S2O5 到15ml 水，加464ul 新鲜配制的10 M NaOH）
6. 加12ul 10mM 氢醌（55mg加水50ml氢醌），混匀并短暂离心
7. 加200 ul 矿物油，防止水分蒸发，限制氧化。
8. 55℃孵育4-16h（水浴）。
9. 吸弃上层矿物油。
10. ①加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin 按照指导书进行脱盐处理。每个管与2.5ml注射器相连，（注意连接紧）用吸管吸到注射器，底加2ml的离心管；轻轻加压，不 要弄破膜；②加2ml 80％的异丙醇洗涤，离心10000rpm，30s，底换管；柱子换到新1.5ml尖EP管，弃注射器；③加50ul预热水（60-70℃）放2-3min；离心（柱子与离心管一起，10000rpm，30s，DNA到EP管，弃柱子；
11. 加50ul 水到minicolumn 室温下静置5min
12. 离心20s 收积洗提液，弃掉minicolumn
13. 加5.5ul 3M NaOH 然后 37℃ 孵育15 min
14. 短暂离心
15. 加 1ul 糖原（10mg/ml）
16. 加33.3ul 5M NH4OAcetate PH 7.0
17. 加330ul 冷（-20℃）100％乙醇，充分混匀
18. －20℃过夜（或者－70℃ 30min）
19. 4℃ 下14000 rpm 离心15min
20. 弃上清，加70％乙醇洗涤，4℃ 下14000 rpm 离心15min。
21. 重悬DNA于10ul 水中，室温下静置～2h，间隔旋涡振荡
22. －20℃保存DNA
hotstar 酶做PCR，或者做Q-PCR
