<讨论>SELDI技术闲谈
丁香园论坛
869
SELDI技术闲谈
我总是在黑白之间徘徊，在那灰色的地带游走。
一，Seldi的原理。
Seldi技术，说来不复杂，ProteinChip和TOF-MS两个部分，有的专家说“蛋白质芯片”这个叫法不正确，当然了，我们以前讲的某某“芯片”是微点阵“Microarray”，不是“Chip”，翻译的问题而已。蛋白质芯片是将传统的生物色谱的表面集团固定到金属片基上，比如Q、NTA、C18这些，所以蛋白质芯片也分成了离子交换、金属螯合、正相反相、疏水、亲和，基本上与常用的色谱方法一一对应，使用的原则和方法基本相同，不同的是基团的固定基质不同，蛋白质芯片重复使用的可能性很小。
时间飞行质谱仪也是很经典的东西了，Seldi和Maldi的主要区别不在这里。
蛋白质芯片和质谱的结合，得到了一个非常方便的测试平台，蛋白质样品可以很方便的结合到芯片上并且立刻测得分子量，这个结合应该说非常聪明，也是大势所趋。现在老牌生物质谱BRUKER，也做了一个类似的Maldi系统，使用的是磁性小球来结合蛋白。
二，由原理说应用。
Seldi能干什么？有什么优缺点？国外的专家已经给出的不少答案。
从蛋白质芯片的原理看，Seldi能结合的蛋白的数量和种类必然是受样品限制的。如果是部分纯化的蛋白质样品，蛋白种类不多，由一种到十几种，缓冲条件与芯片最佳操作条件十分接近的时候，所有的蛋白都可以结合到芯片上从而得到检测，并且可以在一点程度上反应出每种蛋白的含量，做到半定量的分析（如果要做到定量分析，要求的条件就比较多了，那样的话就没必要用质谱了）。
如果是天然样品，没有经过提取，情况就不那么乐观，象血清这种以蛋白质为主的样品，能结合在芯片上而被测定的大部分是具有较高丰度的肽和小分子量的蛋白，原因与色谱相同，结合位点是一定的，在蛋白与集团间的作用力没有巨大差距的时候，分子数量大的分子自然先结合到芯片上而且不会被取代，一旦结合开始，空间位阻也会上升为一个决定结合效率的因素。如果有某些低丰富蛋白能够结合，必然是其与集团间的作用力非常强，结合的速度很“快”。这样的结合情况决定了，一，一种芯片结合的蛋白种类不会很多，一般是几十个到数百个信号，除掉蛋白降解片断和多电荷的分子信号，实际测得的蛋白种类是百这个数量级； 二，信号强度一定程度上由结合力决定，所以不能确定其是否能反映出样品含量，故此不容易做到半定量，或者说不是定量的。
到了组织裂解液和细胞裂解液这里，问题就更复杂了。
EAM（能量吸收剂）与蛋白的关系也是十分微妙的，EAM的质量、样品中非蛋白类杂质的量、EAM与蛋白数量的比例、以及蛋白质分子量的分布，直接影响蛋白分子电离的效果，自然会对测定的结果产生影响。
质谱仪是种复杂的科研仪器，不是电视和DVD，并非大工业生产的产品，每个配件都来自不同的企业和科研单位，各自的稳定性和一致性问题就很复杂，整机自然不能做到很好的一致性和稳定性，每台仪器的性能不同，或者单台仪器不稳定都是正常的现象（不过Seldi的质谱部分实在太突出一点）。
在不考虑蛋白质芯片质量的不稳定和仪器的不稳定性的问题之后，Seldi可以做什么就很明朗了，它适合对天然样品中的部分蛋白和多肽的差异进行发现，实现蛋白质组水平上的大规模样品比较和筛查，它还适合对部分纯化或者纯化样品进行检测，这两点对于任何一个蛋白质研究人员来说都足够值得关注了，尤其是第一个用途，如果使用得当是非常令人兴奋的。
三，用好Seldi。
Seldi的正确使用，从策略上讲，不要利用Seldi的劣势做实验；能细化的实验要细化，能提取的样品要提取，不要求全，求全往往没有任何结果；要做好差异的验证工作，这部分工作的分量应该比发现还要大。
从操作角度讲，由于Seldi技术的灵敏性，从样品采集到试剂的每一环都要严格控制，把不可测定的因素减到最小。同时要注意操作条件的合理性，很多烦杂的操作是没有必要，反而会引入误差，简洁高效的操作流程是Seldi实验成功的基础。制成的蛋白质芯片上结合的非蛋白小分子量杂质一定要少。
Seldi的假阳性可能性非常高，一个原因是系统的灵敏度很高，可以反应外界条件变化造成的影响，而不都是样品内在的规律；二是其分析软件本身是一个分类统计工具，它是不能象研究者那样考虑到很多的问题，这就好象OFFICE，智能但是很多时候智能的不是地方。
四、Seldi与临床检测
Seldi在国内被做为一个有商业价值的医疗设备，Seldi能做临床检测吗？能，现在不是有人已经开始这个项目了嘛，但是投资者要准备赔钱。
第一大赔钱点，Seldi检测到的“标志物”是什么？上面说了Seldi的假阳性可能性很高，有时所谓的“标志物”真的不知道是什么东西，也许就是几个病人同时吃了食堂的哪种过期的食品吧。Seldi不能有效的捕捉低丰度蛋白，癌症组织分泌的特异的蛋白或者其降解产物是否就在血液中有很高含量呢？在癌症发生的早期是不太可能的。国内外2年来的研究表明事实就是如此，Seldi检测到的标志物得到鉴定的都是机体产生的反应性蛋白或者其片断，都是具有高丰度的。如果这种标志物做检测有两个问题，一个是标志物不特异，多种癌症都可能存在这样的标志物，在一个癌症检测模型中，一般只有2－3个分类，如果把B癌症的检测结果放到A检测癌症的模型中，期望的是B癌症被预测为对照，事实恰恰不一定是这样，B癌症很可能大部分变成A癌症，这样的标志物对单项癌症检测还有什么意义？第二个问题是以这种标志物为检测标准假阳性结果高，宣传上和研究上可以说Seldi比甲胎蛋白等现有标志物检测方法好多少好多少，可是在这一点上Seldi技术现在还不如甲胎蛋白。国内外的论文普遍的结果说到灵敏度动辄达到100％，特异性一般在85％左右，这里15％的差距不可谓不小心吧，这还是纯粹的研究。最后Seldi临产检测方案必然成为一个多标志物多疾病的策略型分析检测工具，这个投资可不是什么40例模型，20例双盲就天下太平的了！
第二大赔钱点，芯片和仪器的不稳定性。人员和试剂在实践工作中都是可以控制的，蛋白质芯片是成批次生产的，每批间都可能有质量差异（这种差异已经被事实证明了），仪器又是台台不同的，根本没有标准质谱图这种东西存在，如果再幸运一些，遇到一台经常变化的仪器，这个检测工作如何开展？这些问题不是不可以避免，成本必然飙升。
第三大赔钱点，人工成本。从实验操作上说要求操作者个人的操作稳定性非常高，这需要长期训练，用机器人也是一个办法，这个一样需要更多的钱。Seldi目前的分析软件有几个问题，最严重的两个，一个是不能有效的把双峰或者多峰中的几个峰区分开（如果把MS的分辨率做的高些，这个问题就不存在了，可是Seldi的开发商另有考虑，没这样做）；第二是统计工具适合做2－3个分类，再多效果并不好，这个分类是完全以建立检测模型的数据为基础的，天知道软件分析出来的“标志物”到底是什么东西，下次的测试数据里面如果没有了“标志物”又是怎么回事？这要求数据分析人员有极大的耐心和极丰富的经验去处理、分析和一一验证结果，这个人员的薪水是多少？
第四赔钱点，仪器和耗材。目前的价格已经不低了，供应商只有一个，在现实的利益面前会出现什么情况谁也不能预料，至少现在看供应商不是一个好的商业伙伴。
作为一个商业项目，一技术不成熟，研发费用高昂，二仪器和耗材投入大，三对员工素质要求高，以目前已经开展的单项检测收费价格来看，没有钱赚，如果做一个癌症检测的毛利跟缝双皮鞋差不多，为什么不缝皮鞋去？如果能做到普查，似乎有利可图了，其投入要多大，供应商还能不能长期合作，都是未知啊。
总之，开展临床检测项目是可以为的，也是发展趋势，现在可以不可以，能不能靠Seldi赚钱？理智一些为好，Seldi的设计是一个研究平台，作为一个研究平台尚有不完善的地方，跟一个成熟的临床检测平台就更扯不上关系了。Seldi癌症临床检测项目，任重道远。
五，Seldi与蛋白质组研究
Seldi是个很好的蛋白质组研究工具，工具就是工具，永远是为研究目的服务的，扳手、剪刀一类，它并不能代替产品成为核心。
Seldi技术的原理决定其可能测定某种细胞的蛋白质组，但工作量将是巨大的，目前它最大的问题是单种芯片结合的蛋白数量还嫌少，而且不能方便的对差异进行鉴定，如果能配合2维电泳等传统的蛋白质组学研究技术和蛋白质分离纯化技术，发挥其高通量的优势，展开**度的研究，是非常有价值的。
目前Seldi系统绝大部分分布在美国的科研机构和生物公司，广泛用于生物医药和蛋白质组研究。
六，Seldi中国现象
非常有趣的就是Seldi技术在国内和国外从宣传、销售、服务和用途都存在很大的差异，中国的Seldi系统数量不多，主要分布的在医院和研究机构，绝大部分在进行癌症诊断研究。国内发表的Seldi文章，除了早期的几篇综述是有分量的，并没有高质量的研究文章，内地曾经有两篇文章数据根本经不起推敲，自然结果的可靠性也值得怀疑，这在学术欺诈盛行的今天，就算是好的了，这些文章还都是有Seldi系统制造公司人员参予的。反观香港的数篇文章，有理有据，研究和探讨深入，行文严谨，也不隐讳其研究成果，与内地的同行抱着假标志物忙着去申请专利的形象大为不同，内地的科研工作者当汗颜。从这些香港的文献可以发现一个共同点，很值得思考。对方是以怎样的出发点和方法使用Seldi的？这里Seldi成为一个完全的测试仪器，跟我们的721光度计一个地位，功夫全在Seldi外。再观外国的文章，作者都能客观和深入的研究和探讨问题，不隐讳研究成果，并且很客观的讲到这些研究成果对于未来的疾病诊断研究是有意义的，跟我们的文章中“建立了几个模型，可以用于疾病诊断”处理方法是如此不同，我们怎么高得象卖假古董一样？这是科学的态度吗？
这些现象产生的根源有三：
第一个，国内科研水平有限，有时有急功近利思想，合作精神差，这些是可以理解的，看这个帖子的也都是专家，说到底还是经济的问题吧。
第二个，Seldi制作商在中国通过不实宣传误导科研工作者，把科研仪器说成能赚钱的临床仪器，好象能下金蛋的母鸡一样，殊不知什么母鸡都能下金蛋，可是要仙女抱着才行，母鸡有了，仙女呢？这是赤裸裸的短期商业行为。
第三个，Seldi制作商在中国提供的技术支持和服务不足，客户技术培训不到位，仪器出了问题处理的很慢，支持和服务人员的素质有下降的趋势，这跟美国技术支持和服务人员的高素质和高反应速度形成鲜明的对比，在美国很多的项目都有技术支持人员参与，得到了强有力的支持。国内研究出菜慢自然可以理解了。
科学家不是奸商，奸商也不要做科学家。
结语：林林总总写了这么多，有一笔带过的，也有谴责的内容，这些都不是目的，目的是希望从多个角度探讨Seldi技术，认识Seldi，还它一个清楚的本来面目，做到物尽其用，这里具体的实验操作谈及的不多，功夫都是在Seldi之外的，到具体的研究，我愿意和大家探讨，欢迎转贴。
我总是在黑白之间徘徊，在那灰色的地带游走。
一，Seldi的原理。
Seldi技术，说来不复杂，ProteinChip和TOF-MS两个部分，有的专家说“蛋白质芯片”这个叫法不正确，当然了，我们以前讲的某某“芯片”是微点阵“Microarray”，不是“Chip”，翻译的问题而已。蛋白质芯片是将传统的生物色谱的表面集团固定到金属片基上，比如Q、NTA、C18这些，所以蛋白质芯片也分成了离子交换、金属螯合、正相反相、疏水、亲和，基本上与常用的色谱方法一一对应，使用的原则和方法基本相同，不同的是基团的固定基质不同，蛋白质芯片重复使用的可能性很小。
时间飞行质谱仪也是很经典的东西了，Seldi和Maldi的主要区别不在这里。
蛋白质芯片和质谱的结合，得到了一个非常方便的测试平台，蛋白质样品可以很方便的结合到芯片上并且立刻测得分子量，这个结合应该说非常聪明，也是大势所趋。现在老牌生物质谱BRUKER，也做了一个类似的Maldi系统，使用的是磁性小球来结合蛋白。
二，由原理说应用。
Seldi能干什么？有什么优缺点？国外的专家已经给出的不少答案。
从蛋白质芯片的原理看，Seldi能结合的蛋白的数量和种类必然是受样品限制的。如果是部分纯化的蛋白质样品，蛋白种类不多，由一种到十几种，缓冲条件与芯片最佳操作条件十分接近的时候，所有的蛋白都可以结合到芯片上从而得到检测，并且可以在一点程度上反应出每种蛋白的含量，做到半定量的分析（如果要做到定量分析，要求的条件就比较多了，那样的话就没必要用质谱了）。
如果是天然样品，没有经过提取，情况就不那么乐观，象血清这种以蛋白质为主的样品，能结合在芯片上而被测定的大部分是具有较高丰度的肽和小分子量的蛋白，原因与色谱相同，结合位点是一定的，在蛋白与集团间的作用力没有巨大差距的时候，分子数量大的分子自然先结合到芯片上而且不会被取代，一旦结合开始，空间位阻也会上升为一个决定结合效率的因素。如果有某些低丰富蛋白能够结合，必然是其与集团间的作用力非常强，结合的速度很“快”。这样的结合情况决定了，一，一种芯片结合的蛋白种类不会很多，一般是几十个到数百个信号，除掉蛋白降解片断和多电荷的分子信号，实际测得的蛋白种类是百这个数量级； 二，信号强度一定程度上由结合力决定，所以不能确定其是否能反映出样品含量，故此不容易做到半定量，或者说不是定量的。
到了组织裂解液和细胞裂解液这里，问题就更复杂了。
EAM（能量吸收剂）与蛋白的关系也是十分微妙的，EAM的质量、样品中非蛋白类杂质的量、EAM与蛋白数量的比例、以及蛋白质分子量的分布，直接影响蛋白分子电离的效果，自然会对测定的结果产生影响。
质谱仪是种复杂的科研仪器，不是电视和DVD，并非大工业生产的产品，每个配件都来自不同的企业和科研单位，各自的稳定性和一致性问题就很复杂，整机自然不能做到很好的一致性和稳定性，每台仪器的性能不同，或者单台仪器不稳定都是正常的现象（不过Seldi的质谱部分实在太突出一点）。
在不考虑蛋白质芯片质量的不稳定和仪器的不稳定性的问题之后，Seldi可以做什么就很明朗了，它适合对天然样品中的部分蛋白和多肽的差异进行发现，实现蛋白质组水平上的大规模样品比较和筛查，它还适合对部分纯化或者纯化样品进行检测，这两点对于任何一个蛋白质研究人员来说都足够值得关注了，尤其是第一个用途，如果使用得当是非常令人兴奋的。
三，用好Seldi。
Seldi的正确使用，从策略上讲，不要利用Seldi的劣势做实验；能细化的实验要细化，能提取的样品要提取，不要求全，求全往往没有任何结果；要做好差异的验证工作，这部分工作的分量应该比发现还要大。
从操作角度讲，由于Seldi技术的灵敏性，从样品采集到试剂的每一环都要严格控制，把不可测定的因素减到最小。同时要注意操作条件的合理性，很多烦杂的操作是没有必要，反而会引入误差，简洁高效的操作流程是Seldi实验成功的基础。制成的蛋白质芯片上结合的非蛋白小分子量杂质一定要少。
Seldi的假阳性可能性非常高，一个原因是系统的灵敏度很高，可以反应外界条件变化造成的影响，而不都是样品内在的规律；二是其分析软件本身是一个分类统计工具，它是不能象研究者那样考虑到很多的问题，这就好象OFFICE，智能但是很多时候智能的不是地方。
四、Seldi与临床检测
Seldi在国内被做为一个有商业价值的医疗设备，Seldi能做临床检测吗？能，现在不是有人已经开始这个项目了嘛，但是投资者要准备赔钱。
第一大赔钱点，Seldi检测到的“标志物”是什么？上面说了Seldi的假阳性可能性很高，有时所谓的“标志物”真的不知道是什么东西，也许就是几个病人同时吃了食堂的哪种过期的食品吧。Seldi不能有效的捕捉低丰度蛋白，癌症组织分泌的特异的蛋白或者其降解产物是否就在血液中有很高含量呢？在癌症发生的早期是不太可能的。国内外2年来的研究表明事实就是如此，Seldi检测到的标志物得到鉴定的都是机体产生的反应性蛋白或者其片断，都是具有高丰度的。如果这种标志物做检测有两个问题，一个是标志物不特异，多种癌症都可能存在这样的标志物，在一个癌症检测模型中，一般只有2－3个分类，如果把B癌症的检测结果放到A检测癌症的模型中，期望的是B癌症被预测为对照，事实恰恰不一定是这样，B癌症很可能大部分变成A癌症，这样的标志物对单项癌症检测还有什么意义？第二个问题是以这种标志物为检测标准假阳性结果高，宣传上和研究上可以说Seldi比甲胎蛋白等现有标志物检测方法好多少好多少，可是在这一点上Seldi技术现在还不如甲胎蛋白。国内外的论文普遍的结果说到灵敏度动辄达到100％，特异性一般在85％左右，这里15％的差距不可谓不小心吧，这还是纯粹的研究。最后Seldi临产检测方案必然成为一个多标志物多疾病的策略型分析检测工具，这个投资可不是什么40例模型，20例双盲就天下太平的了！
第二大赔钱点，芯片和仪器的不稳定性。人员和试剂在实践工作中都是可以控制的，蛋白质芯片是成批次生产的，每批间都可能有质量差异（这种差异已经被事实证明了），仪器又是台台不同的，根本没有标准质谱图这种东西存在，如果再幸运一些，遇到一台经常变化的仪器，这个检测工作如何开展？这些问题不是不可以避免，成本必然飙升。
第三大赔钱点，人工成本。从实验操作上说要求操作者个人的操作稳定性非常高，这需要长期训练，用机器人也是一个办法，这个一样需要更多的钱。Seldi目前的分析软件有几个问题，最严重的两个，一个是不能有效的把双峰或者多峰中的几个峰区分开（如果把MS的分辨率做的高些，这个问题就不存在了，可是Seldi的开发商另有考虑，没这样做）；第二是统计工具适合做2－3个分类，再多效果并不好，这个分类是完全以建立检测模型的数据为基础的，天知道软件分析出来的“标志物”到底是什么东西，下次的测试数据里面如果没有了“标志物”又是怎么回事？这要求数据分析人员有极大的耐心和极丰富的经验去处理、分析和一一验证结果，这个人员的薪水是多少？
第四赔钱点，仪器和耗材。目前的价格已经不低了，供应商只有一个，在现实的利益面前会出现什么情况谁也不能预料，至少现在看供应商不是一个好的商业伙伴。
作为一个商业项目，一技术不成熟，研发费用高昂，二仪器和耗材投入大，三对员工素质要求高，以目前已经开展的单项检测收费价格来看，没有钱赚，如果做一个癌症检测的毛利跟缝双皮鞋差不多，为什么不缝皮鞋去？如果能做到普查，似乎有利可图了，其投入要多大，供应商还能不能长期合作，都是未知啊。
总之，开展临床检测项目是可以为的，也是发展趋势，现在可以不可以，能不能靠Seldi赚钱？理智一些为好，Seldi的设计是一个研究平台，作为一个研究平台尚有不完善的地方，跟一个成熟的临床检测平台就更扯不上关系了。Seldi癌症临床检测项目，任重道远。
五，Seldi与蛋白质组研究
Seldi是个很好的蛋白质组研究工具，工具就是工具，永远是为研究目的服务的，扳手、剪刀一类，它并不能代替产品成为核心。
Seldi技术的原理决定其可能测定某种细胞的蛋白质组，但工作量将是巨大的，目前它最大的问题是单种芯片结合的蛋白数量还嫌少，而且不能方便的对差异进行鉴定，如果能配合2维电泳等传统的蛋白质组学研究技术和蛋白质分离纯化技术，发挥其高通量的优势，展开**度的研究，是非常有价值的。
目前Seldi系统绝大部分分布在美国的科研机构和生物公司，广泛用于生物医药和蛋白质组研究。
六，Seldi中国现象
非常有趣的就是Seldi技术在国内和国外从宣传、销售、服务和用途都存在很大的差异，中国的Seldi系统数量不多，主要分布的在医院和研究机构，绝大部分在进行癌症诊断研究。国内发表的Seldi文章，除了早期的几篇综述是有分量的，并没有高质量的研究文章，内地曾经有两篇文章数据根本经不起推敲，自然结果的可靠性也值得怀疑，这在学术欺诈盛行的今天，就算是好的了，这些文章还都是有Seldi系统制造公司人员参予的。反观香港的数篇文章，有理有据，研究和探讨深入，行文严谨，也不隐讳其研究成果，与内地的同行抱着假标志物忙着去申请专利的形象大为不同，内地的科研工作者当汗颜。从这些香港的文献可以发现一个共同点，很值得思考。对方是以怎样的出发点和方法使用Seldi的？这里Seldi成为一个完全的测试仪器，跟我们的721光度计一个地位，功夫全在Seldi外。再观外国的文章，作者都能客观和深入的研究和探讨问题，不隐讳研究成果，并且很客观的讲到这些研究成果对于未来的疾病诊断研究是有意义的，跟我们的文章中“建立了几个模型，可以用于疾病诊断”处理方法是如此不同，我们怎么高得象卖假古董一样？这是科学的态度吗？
这些现象产生的根源有三：
第一个，国内科研水平有限，有时有急功近利思想，合作精神差，这些是可以理解的，看这个帖子的也都是专家，说到底还是经济的问题吧。
第二个，Seldi制作商在中国通过不实宣传误导科研工作者，把科研仪器说成能赚钱的临床仪器，好象能下金蛋的母鸡一样，殊不知什么母鸡都能下金蛋，可是要仙女抱着才行，母鸡有了，仙女呢？这是赤裸裸的短期商业行为。
第三个，Seldi制作商在中国提供的技术支持和服务不足，客户技术培训不到位，仪器出了问题处理的很慢，支持和服务人员的素质有下降的趋势，这跟美国技术支持和服务人员的高素质和高反应速度形成鲜明的对比，在美国很多的项目都有技术支持人员参与，得到了强有力的支持。国内研究出菜慢自然可以理解了。
科学家不是奸商，奸商也不要做科学家。
结语：林林总总写了这么多，有一笔带过的，也有谴责的内容，这些都不是目的，目的是希望从多个角度探讨Seldi技术，认识Seldi，还它一个清楚的本来面目，做到物尽其用，这里具体的实验操作谈及的不多，功夫都是在Seldi之外的，到具体的研究，我愿意和大家探讨，欢迎转贴。
