表观分子量的判定实验

1.将目的蛋白和标准分子量蛋白上样到同一块 SDS-PAGE 平板凝胶中，按照方案 1 的步骤进行 SDS-PAGE。

在同一块平板凝胶上进行目的蛋白和标准分子量蛋白的电泳，可以消除由于丙烯酰胺浓度和电泳条件不同而产生的差异。可以通过商业途径获得多种标准蛋白试剂盒，标准蛋白及其分子量的详细资料也可在 Weber 和 Osborn(1969)、Neville(1971) 以及 Hames(1990) 中找到。若要用此方法更精细地测定分子量，最好能采用不同浓度的丙烯酰胺凝胶（Ferguson,1964;Neville,1971)。关于在使用多种市售标准蛋白进行 SDS-PAGE 时，聚丙烯酰胺和交联剂两者浓度对蛋白迁移的影响，在 Makowski 和 Ramsby(1997) 中有详细讨论。

2.电泳结束后，进行蛋白染色（方案 2?~7)。

3.（可选或不选）在测量尺 F 值之前干燥凝胶。

4.测量蛋白和示踪染料（通常是溴酚蓝）迁移的距离。

5.计算相对迁移率（Rf 值）：

R_F=蛋白迁移的距离/示踪染料迁移的距离

6.用迁移率对已知 Mr 的半对数作图。凝胶中部各点应几乎在一直线上（见图 2.7)。

7.通过未知蛋白的R_F 值从曲线图上读出未知蛋白的 Mr。

要点：每块胶应重新绘制标准曲线。