PCR没结果，是模板有问题马?
丁香园论坛
2269
做半个月RT-PCR了，内参条带没问题，可是目的基因始终不露面。使我的模板有问题马？下面是我测得总RNA的OD:0.133{A230}、0.270{A260}、0.133{A280}、0.08{A320}.A260/A280=2.03 、A260/A230=2.03
我得模板零下80放了一年多，现在做RT-PCR，退火温度、镁离子浓度、循环数都试过来了，老是不出结果，我都不知道下部要怎么做了。。。。郁闷死了。下面使我的试验步骤， 烦请各位高手帮帮我把。。
cDNA第一链的合成（反转录反应）
1. 调整各RNA样品浓度至1μg/μl，取2μl为模板。
2. 在每一反应管中依次加入下列试剂：
Mgcl2 2μl
10×RT Buffer 1μl
RNase Free dHO 2.75μl
dNTP Mixture(各10Mm) 1μl
RNase inhibitor 0.25μl
Reverse Transcriptase 0.5μl
特异性下游引物 0.5μl
Total RNA 2μl
Total 10μl
3. 按以下条件进行反转录反应：
42℃ 30min
99℃ 5min
5℃ 5min
PCR反应：
1. 按以下组成配制PCR反应液：
10×PCR Buffer 2.5μl
灭菌水 14μl
Taq酶 0.625μ
特异性上游引物 0.25μl
特异性下游引物 0.25μl
cDNA第一链 5μl
dNTP Mixture(各2.5Mm) 2. 5μl
Total 25μl
2. 将配制的25μl PCR反应液加入反应管中。
3. 按以下条件进行PCR反应：
94℃ 2min
94℃ 30sec
55℃ 30sec 40个循环
72℃ 1min
72℃ 7min
琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增产物
1. 灌胶：用1×TBE电泳缓冲液配制2％的琼脂糖凝胶，微波炉中加热熔化，冷却至60℃左右时灌入胶槽中。室温下完全凝固后，小心拔出样品梳，将凝胶放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液至高出胶面1-2mm。
2. 电泳：取5μl各组RARα及RARβ扩增产物，加1μl琼脂糖凝胶上样缓冲液，混匀后上样于样品孔中。DNA marker 5μl上样。接通电源，调整电压为5V/cm，电泳1h左右。EB（0.5 μg/ml）染色10min，蒸馏水脱色摇床振荡漂洗30min。紫外透射仪下观察电泳结果
我得模板零下80放了一年多，现在做RT-PCR，退火温度、镁离子浓度、循环数都试过来了，老是不出结果，我都不知道下部要怎么做了。。。。郁闷死了。下面使我的试验步骤， 烦请各位高手帮帮我把。。
cDNA第一链的合成（反转录反应）
1. 调整各RNA样品浓度至1μg/μl，取2μl为模板。
2. 在每一反应管中依次加入下列试剂：
Mgcl2 2μl
10×RT Buffer 1μl
RNase Free dHO 2.75μl
dNTP Mixture(各10Mm) 1μl
RNase inhibitor 0.25μl
Reverse Transcriptase 0.5μl
特异性下游引物 0.5μl
Total RNA 2μl
Total 10μl
3. 按以下条件进行反转录反应：
42℃ 30min
99℃ 5min
5℃ 5min
PCR反应：
1. 按以下组成配制PCR反应液：
10×PCR Buffer 2.5μl
灭菌水 14μl
Taq酶 0.625μ
特异性上游引物 0.25μl
特异性下游引物 0.25μl
cDNA第一链 5μl
dNTP Mixture(各2.5Mm) 2. 5μl
Total 25μl
2. 将配制的25μl PCR反应液加入反应管中。
3. 按以下条件进行PCR反应：
94℃ 2min
94℃ 30sec
55℃ 30sec 40个循环
72℃ 1min
72℃ 7min
琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增产物
1. 灌胶：用1×TBE电泳缓冲液配制2％的琼脂糖凝胶，微波炉中加热熔化，冷却至60℃左右时灌入胶槽中。室温下完全凝固后，小心拔出样品梳，将凝胶放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液至高出胶面1-2mm。
2. 电泳：取5μl各组RARα及RARβ扩增产物，加1μl琼脂糖凝胶上样缓冲液，混匀后上样于样品孔中。DNA marker 5μl上样。接通电源，调整电压为5V/cm，电泳1h左右。EB（0.5 μg/ml）染色10min，蒸馏水脱色摇床振荡漂洗30min。紫外透射仪下观察电泳结果
