PCR没结果,是模板有问题马?
丁香园论坛
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做半个月RT-PCR了,内参条带没问题,可是目的基因始终不露面。使我的模板有问题马?下面是我测得总RNA的OD:0.133{A230}、0.270{A260}、0.133{A280}、0.08{A320}.A260/A280=2.03 、A260/A230=2.03
我得模板零下80放了一年多,现在做RT-PCR,退火温度、镁离子浓度、循环数都试过来了,老是不出结果,我都不知道下部要怎么做了。。。。郁闷死了。下面使我的试验步骤, 烦请各位高手帮帮我把。。
cDNA第一链的合成(反转录反应)
1. 调整各RNA样品浓度至1μg/μl,取2μl为模板。
2. 在每一反应管中依次加入下列试剂:
Mgcl2 2μl
10×RT Buffer 1μl
RNase Free dHO 2.75μl
dNTP Mixture(各10Mm) 1μl
RNase inhibitor 0.25μl
Reverse Transcriptase 0.5μl
特异性下游引物 0.5μl
Total RNA 2μl
Total 10μl
3. 按以下条件进行反转录反应:
42℃ 30min
99℃ 5min
5℃ 5min
PCR反应:
1. 按以下组成配制PCR反应液:
10×PCR Buffer 2.5μl
灭菌水 14μl
Taq酶 0.625μ
特异性上游引物 0.25μl
特异性下游引物 0.25μl
cDNA第一链 5μl
dNTP Mixture(各2.5Mm) 2. 5μl
Total 25μl
2. 将配制的25μl PCR反应液加入反应管中。
3. 按以下条件进行PCR反应:
94℃ 2min
94℃ 30sec
55℃ 30sec 40个循环
72℃ 1min
72℃ 7min
琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增产物
1. 灌胶:用1×TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖凝胶,微波炉中加热熔化,冷却至60℃左右时灌入胶槽中。室温下完全凝固后,小心拔出样品梳,将凝胶放入电泳槽中,加入0.5×TBE电泳缓冲液至高出胶面1-2mm。
2. 电泳:取5μl各组RARα及RARβ扩增产物,加1μl琼脂糖凝胶上样缓冲液,混匀后上样于样品孔中。DNA marker 5μl上样。接通电源,调整电压为5V/cm,电泳1h左右。EB(0.5 μg/ml)染色10min,蒸馏水脱色摇床振荡漂洗30min。紫外透射仪下观察电泳结果
我得模板零下80放了一年多,现在做RT-PCR,退火温度、镁离子浓度、循环数都试过来了,老是不出结果,我都不知道下部要怎么做了。。。。郁闷死了。下面使我的试验步骤, 烦请各位高手帮帮我把。。
cDNA第一链的合成(反转录反应)
1. 调整各RNA样品浓度至1μg/μl,取2μl为模板。
2. 在每一反应管中依次加入下列试剂:
Mgcl2 2μl
10×RT Buffer 1μl
RNase Free dHO 2.75μl
dNTP Mixture(各10Mm) 1μl
RNase inhibitor 0.25μl
Reverse Transcriptase 0.5μl
特异性下游引物 0.5μl
Total RNA 2μl
Total 10μl
3. 按以下条件进行反转录反应:
42℃ 30min
99℃ 5min
5℃ 5min
PCR反应:
1. 按以下组成配制PCR反应液:
10×PCR Buffer 2.5μl
灭菌水 14μl
Taq酶 0.625μ
特异性上游引物 0.25μl
特异性下游引物 0.25μl
cDNA第一链 5μl
dNTP Mixture(各2.5Mm) 2. 5μl
Total 25μl
2. 将配制的25μl PCR反应液加入反应管中。
3. 按以下条件进行PCR反应:
94℃ 2min
94℃ 30sec
55℃ 30sec 40个循环
72℃ 1min
72℃ 7min
琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR扩增产物
1. 灌胶:用1×TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖凝胶,微波炉中加热熔化,冷却至60℃左右时灌入胶槽中。室温下完全凝固后,小心拔出样品梳,将凝胶放入电泳槽中,加入0.5×TBE电泳缓冲液至高出胶面1-2mm。
2. 电泳:取5μl各组RARα及RARβ扩增产物,加1μl琼脂糖凝胶上样缓冲液,混匀后上样于样品孔中。DNA marker 5μl上样。接通电源,调整电压为5V/cm,电泳1h左右。EB(0.5 μg/ml)染色10min,蒸馏水脱色摇床振荡漂洗30min。紫外透射仪下观察电泳结果