【原创】陈氏克隆简明手册
丁香园论坛
2704
看到论坛里还是有同学请教克隆的问题，因为在以前的实验室里也经常做克隆，就整理了自己的一点经验，发在这里，希望能抛砖引玉，大家踊跃来讨论。实验的过程和标准过程差不多，只不过有些改进，缩短了一些步骤的时长。
实验室常讲的克隆，意思是将一段序列连接到细菌（一般是大肠杆菌）的DNA中，随着大肠杆菌的不断繁殖，而达到使目标序列无限复制的目的。
明确概念后，要讲讲克隆在实验室中到底有什么作用。
最常见的是：1.要测序的PCR产物条带太暗，测序无信号；2.测序的PCR产物不单一，混有和目序列大小十分接近的其他序列，测序重叠峰，测序失败；3.一些特殊的序列需求，比如核基因，杂合子具有有两个或者两个以上的等位基因，要想获得杂合子某个基因片段的序列，必须通过克隆的方法；4.其他一些特殊要求。
明确了克隆在实验室中的作用之后，接下来就是本日志的主题了，陈氏克隆简明步骤
1.克隆之前的准备工作
需要有：准备好的已经经过PCR产物纯化，或者是切胶纯化的样品，一般要求目的序列的片段不要太大，否则一般的载体难以连接，也难以转化进细胞；
感受态细胞，以前为了省钱，往往都是自己制作感受态细胞，虽然制作感受态细胞不是很费事，但是往往不太稳定，所以，为了图省事，而且为了实验的稳定进行，现在都是直接购买公司里已经做好的感受态细胞，本实验室常用的是Takara的DH5α；
清洗培养皿，一般在要做克隆的2-3天前，就要将培养皿用洗衣粉泡1-2天，然后用清水洗净培养皿，用单蒸水涮洗2-3次，确保没有洗衣粉的残留，晾干后，用报纸包好，高压蒸汽灭菌，在烘箱里烘干，备用
培养基，一般采用LB培养基，有些人还会配置SOC培养基，以增加扩大培养时细胞的产量，其实用一般的LB培养基就行了，细胞也能长得很好，而且配置SOC培养基比较麻烦，克隆用的培养基分为两种：固体培养基和液体培养基，两者配方基本相同，只不过是固体培养基多加了琼脂，以配置100mL固体培养基为例，说明培养基配方：
胰蛋白胨 1g
酵母提取物 0.5g
NaCl 1g
去离子水 95mL
琼脂 1.5g
注意：琼脂不是琼脂糖，二者不一样
在锥形瓶里加好所需的药品之后，用锡箔纸包住锥形瓶瓶口，就可以去灭菌了，不必等到药品溶解，因为在高压灭菌的时候，其实也是混匀溶解的过程；
倒平板（超净台上操作），实验室现在往往采用蓝白斑+Amp筛选，这样挑到假阳性克隆的几率比较小。所以倒平板的时候还得额外准备Amp，X-Gel，IPTG，实验过程如下：
在将固体培养基和液体培养基送去高压灭菌之后，要将如下物品放在超净台进行紫外灭菌（时间30分钟）：
烘干的培养皿（进行灭菌的时候，要将报纸撕开，露出培养皿）、黄枪（量程为100μ或者200μ的都可以）、已经灭菌过的黄枪头（没在外面开过的）、酒精灯、打火机、记号笔、酒精棉球、保鲜膜、1.5Ep管（5-10个）
一般高压灭菌的时间为1小时左右，在灭菌快结束的时候，取出保存在-20℃的Amp、X-Gel和IPTG（注意：新购买的Amp为粉末，需要稀释，X-Gel和IPTG需要根据试剂说明书进行相应处理，X-Gel应避光保存和使用），常温化冻。
关掉紫外之后，将灭好菌的固体培养基和液体培养基都放在超净台上，等固体培养基冷却到不是太烫手的时候，就可以开始依据一定的比例往固体培养基中加Amp、X-Gel和IPTG，本实验室的通常做法是，每100mL固体培养基，加入70μAmp、200μX-Gel和80μIPTG，注意，加这三样的顺序没有关系，但是在加X-Gel的时候必须关灯，暗处操作，等X-Gel和IPTG都加进培养基后，晃动几下，使药品混匀，之后就可以开灯了。
加好药品之后，就可以开始倒平板了，注意倒平板的时候，每块平板都要一次性倒成，否则凝固后的培养基容易分层，刚倒的培养基先不要盖上盖子，等培养基在超净台完全冷却后，方可盖上培养皿盖子（这样培养皿盖子上就不会有水滴形成），之后，可以3-4个培养皿为单位，用保鲜膜包好，放在4℃冰箱备用。
而取出的液体培养基，则需等其冷却之后，先取出10-15mL分装到1.5Ep管中备用，之后根据相应的体积，加入相应的Amp，用锡箔纸封好锥形瓶瓶口后，置于4℃冰箱备用。
2.连接
克隆的第一步，往往在第一天的晚上进行
采用的连接体系如下：
pMD19-T vecter 1μL
样品 1μL
dd水 3μL
Solution I 5μL
注意取出载体的时候，要将试剂盒中暂时用不到的物品迅速放回冰箱，手指尽量不要接触装载体的离心管底部，因为在-20℃冰箱冻存，载体在使用的时候，必须插入碎冰中化冻，不能用手捂。
加好连接体系之后，置于16℃水浴或者金属浴连接过夜，尽量连接体系保持平稳，不要晃动。
3.连接PCR（本步骤非必须步骤，不过建议新手要做）
连接PCR是为了检测样品是否已经成功和载体连接而做的。一般在第二天早上将连接体系从水浴锅中取出，以连接液为模版，进行连接PCR，剩余的连接液放在4℃冰箱备用，如果要长时间保存，需放在-20℃冰箱，可以保存1-2周的时间。以实验室常用的20μ连接PCR体系说明如下：
PCR buffer（Mg 2+ Free） 2μL
Mg 2+ 1.5μL
dNTP 1μL
连接液 1μL
M13 F 0.5μL
M13 R 0.5μL
Taq 0.2μL
dd水 15.6μL
常用的连接PCR 程序：
95℃ 5min
95℃ 30s
53℃ 1min
72℃ 1min
2 to 5 24 个循环，总计25个
72℃ 8min
15℃ forever
跑好PCR程序之后，检测产物，目的片段加200bp大小处有条带，且拖尾，则说明连接成功，可以用于后续实验。
4.转化
转化是克隆实验过程中重要的一步，转化效率的高低直接影响克隆结果的好坏。
在进行转化之前，需要在超净台上进行紫外灭菌的物品有：
黄枪（量程为200μL或100μL）、白枪（量程为10μL）、已经灭菌过的黄枪头和白枪头（没在外面开过的）、倒平板之前分装出来的AMP- LB培养基、酒精灯、打火机、酒精棉球、记号笔、以及适量的1.5mLEp管
实验步骤：
从-70℃冰箱中取出感受态细胞，注意：感受态细胞比较脆弱，细胞从冰箱中取出后，要立即埋在冰中。等细胞融化之后，就可以进行下一步操作了，一般情况下，埋在冰中的细胞需要3-5分钟，就能完全融化。
关闭紫外灯，在超净台上将细胞以25-30μL的量，分装到1.5Ep管中，每管细胞加3-5μL连接液，冰浴30min，这里说明一下，买的感受态细胞的包装量一般都是100μL一管，实验室为了节约成本，经过实际验证，发现25-30μL的细胞，就足够一次克隆所需，所以在事先要安排好一次克隆的样品量，一般情况下都是3-4个样品1管细胞的预算安排。
在细胞冰浴的时候，打开水浴锅，温度设置为42℃，冰浴结束后，需要42℃热激90s（时间要准确，用秒表计时），之后冰浴1min。注意：热激时最好将Ep管插在浮板中，尽量使Ep管不要晃动。
在超净台上，往感受态细胞中加入300μL Amp- LB培养基，小心吹打一下，使细胞悬浮在培养基中， 37℃ 250转 培养60min。
5.涂平板（超净台上操作） 在培养细胞的时候，继续在超净台开紫外灯灭菌，包括以下物品：
黄枪（量程为200μL或100μL）、已经灭菌过的黄枪头（没在外面开过的）、涂布棒、酒精、酒精棉球、打火机、酒精灯、记号笔、已经倒好的平板
一般涂布的菌液量为80-120μL/板，如果细胞浓度太浓或太稀，可以适当调整用量。
将涂布棒蘸上酒精，在酒精灯上烧干净，注意烧的时候要不时转动涂布棒，保证杀死涂布棒上的细菌，冷却备用（注意涂布棒的弯头不能接触其他东西）吸取80-120μL摇好的菌液，打在平板靠近边缘的地方，用涂布棒将菌液在培养基上均匀涂开，涂布的时候，如果怕涂布棒还未完全冷却，可以将涂布棒的弯头紧贴培养皿盖子的内壁，用手指触摸培养皿盖子外壁，感受是否有温度。
涂好的平板先在37℃正放培养20-30min，等菌液完全被培养皿吸收之后，倒置，37℃培养过夜。
一般在下午2-3点钟开始做转化，4点左右涂平板，这样涂完平板之后，正放20-30分钟的时间，就不必干等着，刚好可以去吃顿晚饭。
6.挑克隆
一般在第三天早上6点多的时候，检查培养箱内的培养皿上细菌生长情况，正常情况下涂在培养基上的大肠杆菌需要12-16小时的生长时间，时间太短，细菌菌落太小，时间太长，细菌容易长老。如果发现培养皿上的细菌菌落大小比较合适了，就取出培养皿，放在4℃冰箱约1小时，这样做的目的是使空载的菌落完全显示蓝斑。
在这期间，需要将以下物品放置在超净台进行紫外灭菌：
白枪（量程为10μL）、蓝枪（量程为1000μL）、已经灭菌过的白枪头和白枪头（没在外面开过的）、酒精灯、打火机、酒精棉球、记号笔、加了Amp的LB液体培养基、离心管架、适量1.5Ep管。
等时间差不多的时候，就可以在超净台上挑克隆了，一般一个平板挑8-16个，尽量挑成8的倍数，这样做菌落PCR的时候，就比较容易用八联管处理。挑克隆之前，应该在1.5Ep管（有些实验室采用的是玻璃试管）中加入一定量的Amp+ LB液体培养基，本实验室一般加600μL/管，这样摇菌摇出来的结果还比较好的。
挑克隆的时候注意，用枪头轻轻刮取培养基上的单菌落，不要刮取2个或2个以上的菌落，也不要刮取蓝斑菌落（空载），太小的菌落也不适宜刮取，挑克隆的时候尽量避免戳破培养基。
挑好克隆之后，就可以将Ep管置于37℃
250转的摇床中进行摇菌，一般摇4小时左右即可，轻轻颠倒Ep管，如果发现培养基内有发烟状沉淀或者雾状沉淀，则表明该管培养基内细胞生长良好，可以停止摇菌。
7.菌落PCR 一般采用的是15μL体系进行菌落PCR，体系说明如下
PCRbuffer（Mg 2+ free） 1.5μL
dNTP 1μL
Mg 2+ 1μL
M13 F 0.3μL
M13 R 0.3μL
菌液 0.6μL
Taq 0.1μL
dd水 10.2μL
注意加菌液的时候，最好振荡一下Ep管，以保证能吸取菌液；
菌落PCR程序说明如下：
95℃ 5min
95℃ 30s
53℃ 40s
72℃ 1min
2 to 5 24循环，总计25循环
72℃ 8min
15℃ forever
一般用M13引物扩增获得和目的片段大小接近的菌液，还需要用原有的特异条带进行扩增验证，只有两个PCR都获得和目的片段大小接近的条带，才能证实菌液中细菌携带的是我们所需要的片段，而不是其他片段。
一般菌液送测体积在150-300μL之间，不能全送，以备测序过程中发生意外情况，如某段时间某公司老是说菌液送到公司的时候冻死。
一般菌液测序花费的时间在3天左右，也就是说周一送样，周四能知道测序结果，如果测序结果满意，则说明克隆成功，如果测序结果不满意，则需要好好分析一下实验过程。
下面是一个实验室最简单的克隆步骤，本人只做过1次，效果还可以
1. 16℃连接 30min
2. 取3μL连接液加入30μL感受态细胞中，冰浴30min
3. 42℃热激45s，冰浴1min
4. 加入300μL LB培养基 37℃ 250转 60min
5. 涂平板，37℃正置20min后，倒置过夜
6. 4度冰箱放置1小时，挑克隆，菌落PCR
原文在本人QQ空间可查，需要的同学可以给我发站内信。
实验室常讲的克隆，意思是将一段序列连接到细菌（一般是大肠杆菌）的DNA中，随着大肠杆菌的不断繁殖，而达到使目标序列无限复制的目的。
明确概念后，要讲讲克隆在实验室中到底有什么作用。
最常见的是：1.要测序的PCR产物条带太暗，测序无信号；2.测序的PCR产物不单一，混有和目序列大小十分接近的其他序列，测序重叠峰，测序失败；3.一些特殊的序列需求，比如核基因，杂合子具有有两个或者两个以上的等位基因，要想获得杂合子某个基因片段的序列，必须通过克隆的方法；4.其他一些特殊要求。
明确了克隆在实验室中的作用之后，接下来就是本日志的主题了，陈氏克隆简明步骤
1.克隆之前的准备工作
需要有：准备好的已经经过PCR产物纯化，或者是切胶纯化的样品，一般要求目的序列的片段不要太大，否则一般的载体难以连接，也难以转化进细胞；
感受态细胞，以前为了省钱，往往都是自己制作感受态细胞，虽然制作感受态细胞不是很费事，但是往往不太稳定，所以，为了图省事，而且为了实验的稳定进行，现在都是直接购买公司里已经做好的感受态细胞，本实验室常用的是Takara的DH5α；
清洗培养皿，一般在要做克隆的2-3天前，就要将培养皿用洗衣粉泡1-2天，然后用清水洗净培养皿，用单蒸水涮洗2-3次，确保没有洗衣粉的残留，晾干后，用报纸包好，高压蒸汽灭菌，在烘箱里烘干，备用
培养基，一般采用LB培养基，有些人还会配置SOC培养基，以增加扩大培养时细胞的产量，其实用一般的LB培养基就行了，细胞也能长得很好，而且配置SOC培养基比较麻烦，克隆用的培养基分为两种：固体培养基和液体培养基，两者配方基本相同，只不过是固体培养基多加了琼脂，以配置100mL固体培养基为例，说明培养基配方：
胰蛋白胨 1g
酵母提取物 0.5g
NaCl 1g
去离子水 95mL
琼脂 1.5g
注意：琼脂不是琼脂糖，二者不一样
在锥形瓶里加好所需的药品之后，用锡箔纸包住锥形瓶瓶口，就可以去灭菌了，不必等到药品溶解，因为在高压灭菌的时候，其实也是混匀溶解的过程；
倒平板（超净台上操作），实验室现在往往采用蓝白斑+Amp筛选，这样挑到假阳性克隆的几率比较小。所以倒平板的时候还得额外准备Amp，X-Gel，IPTG，实验过程如下：
在将固体培养基和液体培养基送去高压灭菌之后，要将如下物品放在超净台进行紫外灭菌（时间30分钟）：
烘干的培养皿（进行灭菌的时候，要将报纸撕开，露出培养皿）、黄枪（量程为100μ或者200μ的都可以）、已经灭菌过的黄枪头（没在外面开过的）、酒精灯、打火机、记号笔、酒精棉球、保鲜膜、1.5Ep管（5-10个）
一般高压灭菌的时间为1小时左右，在灭菌快结束的时候，取出保存在-20℃的Amp、X-Gel和IPTG（注意：新购买的Amp为粉末，需要稀释，X-Gel和IPTG需要根据试剂说明书进行相应处理，X-Gel应避光保存和使用），常温化冻。
关掉紫外之后，将灭好菌的固体培养基和液体培养基都放在超净台上，等固体培养基冷却到不是太烫手的时候，就可以开始依据一定的比例往固体培养基中加Amp、X-Gel和IPTG，本实验室的通常做法是，每100mL固体培养基，加入70μAmp、200μX-Gel和80μIPTG，注意，加这三样的顺序没有关系，但是在加X-Gel的时候必须关灯，暗处操作，等X-Gel和IPTG都加进培养基后，晃动几下，使药品混匀，之后就可以开灯了。
加好药品之后，就可以开始倒平板了，注意倒平板的时候，每块平板都要一次性倒成，否则凝固后的培养基容易分层，刚倒的培养基先不要盖上盖子，等培养基在超净台完全冷却后，方可盖上培养皿盖子（这样培养皿盖子上就不会有水滴形成），之后，可以3-4个培养皿为单位，用保鲜膜包好，放在4℃冰箱备用。
而取出的液体培养基，则需等其冷却之后，先取出10-15mL分装到1.5Ep管中备用，之后根据相应的体积，加入相应的Amp，用锡箔纸封好锥形瓶瓶口后，置于4℃冰箱备用。
2.连接
克隆的第一步，往往在第一天的晚上进行
采用的连接体系如下：
pMD19-T vecter 1μL
样品 1μL
dd水 3μL
Solution I 5μL
注意取出载体的时候，要将试剂盒中暂时用不到的物品迅速放回冰箱，手指尽量不要接触装载体的离心管底部，因为在-20℃冰箱冻存，载体在使用的时候，必须插入碎冰中化冻，不能用手捂。
加好连接体系之后，置于16℃水浴或者金属浴连接过夜，尽量连接体系保持平稳，不要晃动。
3.连接PCR（本步骤非必须步骤，不过建议新手要做）
连接PCR是为了检测样品是否已经成功和载体连接而做的。一般在第二天早上将连接体系从水浴锅中取出，以连接液为模版，进行连接PCR，剩余的连接液放在4℃冰箱备用，如果要长时间保存，需放在-20℃冰箱，可以保存1-2周的时间。以实验室常用的20μ连接PCR体系说明如下：
PCR buffer（Mg 2+ Free） 2μL
Mg 2+ 1.5μL
dNTP 1μL
连接液 1μL
M13 F 0.5μL
M13 R 0.5μL
Taq 0.2μL
dd水 15.6μL
常用的连接PCR 程序：
95℃ 5min
95℃ 30s
53℃ 1min
72℃ 1min
2 to 5 24 个循环，总计25个
72℃ 8min
15℃ forever
跑好PCR程序之后，检测产物，目的片段加200bp大小处有条带，且拖尾，则说明连接成功，可以用于后续实验。
4.转化
转化是克隆实验过程中重要的一步，转化效率的高低直接影响克隆结果的好坏。
在进行转化之前，需要在超净台上进行紫外灭菌的物品有：
黄枪（量程为200μL或100μL）、白枪（量程为10μL）、已经灭菌过的黄枪头和白枪头（没在外面开过的）、倒平板之前分装出来的AMP- LB培养基、酒精灯、打火机、酒精棉球、记号笔、以及适量的1.5mLEp管
实验步骤：
从-70℃冰箱中取出感受态细胞，注意：感受态细胞比较脆弱，细胞从冰箱中取出后，要立即埋在冰中。等细胞融化之后，就可以进行下一步操作了，一般情况下，埋在冰中的细胞需要3-5分钟，就能完全融化。
关闭紫外灯，在超净台上将细胞以25-30μL的量，分装到1.5Ep管中，每管细胞加3-5μL连接液，冰浴30min，这里说明一下，买的感受态细胞的包装量一般都是100μL一管，实验室为了节约成本，经过实际验证，发现25-30μL的细胞，就足够一次克隆所需，所以在事先要安排好一次克隆的样品量，一般情况下都是3-4个样品1管细胞的预算安排。
在细胞冰浴的时候，打开水浴锅，温度设置为42℃，冰浴结束后，需要42℃热激90s（时间要准确，用秒表计时），之后冰浴1min。注意：热激时最好将Ep管插在浮板中，尽量使Ep管不要晃动。
在超净台上，往感受态细胞中加入300μL Amp- LB培养基，小心吹打一下，使细胞悬浮在培养基中， 37℃ 250转 培养60min。
5.涂平板（超净台上操作） 在培养细胞的时候，继续在超净台开紫外灯灭菌，包括以下物品：
黄枪（量程为200μL或100μL）、已经灭菌过的黄枪头（没在外面开过的）、涂布棒、酒精、酒精棉球、打火机、酒精灯、记号笔、已经倒好的平板
一般涂布的菌液量为80-120μL/板，如果细胞浓度太浓或太稀，可以适当调整用量。
将涂布棒蘸上酒精，在酒精灯上烧干净，注意烧的时候要不时转动涂布棒，保证杀死涂布棒上的细菌，冷却备用（注意涂布棒的弯头不能接触其他东西）吸取80-120μL摇好的菌液，打在平板靠近边缘的地方，用涂布棒将菌液在培养基上均匀涂开，涂布的时候，如果怕涂布棒还未完全冷却，可以将涂布棒的弯头紧贴培养皿盖子的内壁，用手指触摸培养皿盖子外壁，感受是否有温度。
涂好的平板先在37℃正放培养20-30min，等菌液完全被培养皿吸收之后，倒置，37℃培养过夜。
一般在下午2-3点钟开始做转化，4点左右涂平板，这样涂完平板之后，正放20-30分钟的时间，就不必干等着，刚好可以去吃顿晚饭。
6.挑克隆
一般在第三天早上6点多的时候，检查培养箱内的培养皿上细菌生长情况，正常情况下涂在培养基上的大肠杆菌需要12-16小时的生长时间，时间太短，细菌菌落太小，时间太长，细菌容易长老。如果发现培养皿上的细菌菌落大小比较合适了，就取出培养皿，放在4℃冰箱约1小时，这样做的目的是使空载的菌落完全显示蓝斑。
在这期间，需要将以下物品放置在超净台进行紫外灭菌：
白枪（量程为10μL）、蓝枪（量程为1000μL）、已经灭菌过的白枪头和白枪头（没在外面开过的）、酒精灯、打火机、酒精棉球、记号笔、加了Amp的LB液体培养基、离心管架、适量1.5Ep管。
等时间差不多的时候，就可以在超净台上挑克隆了，一般一个平板挑8-16个，尽量挑成8的倍数，这样做菌落PCR的时候，就比较容易用八联管处理。挑克隆之前，应该在1.5Ep管（有些实验室采用的是玻璃试管）中加入一定量的Amp+ LB液体培养基，本实验室一般加600μL/管，这样摇菌摇出来的结果还比较好的。
挑克隆的时候注意，用枪头轻轻刮取培养基上的单菌落，不要刮取2个或2个以上的菌落，也不要刮取蓝斑菌落（空载），太小的菌落也不适宜刮取，挑克隆的时候尽量避免戳破培养基。
挑好克隆之后，就可以将Ep管置于37℃
250转的摇床中进行摇菌，一般摇4小时左右即可，轻轻颠倒Ep管，如果发现培养基内有发烟状沉淀或者雾状沉淀，则表明该管培养基内细胞生长良好，可以停止摇菌。
7.菌落PCR 一般采用的是15μL体系进行菌落PCR，体系说明如下
PCRbuffer（Mg 2+ free） 1.5μL
dNTP 1μL
Mg 2+ 1μL
M13 F 0.3μL
M13 R 0.3μL
菌液 0.6μL
Taq 0.1μL
dd水 10.2μL
注意加菌液的时候，最好振荡一下Ep管，以保证能吸取菌液；
菌落PCR程序说明如下：
95℃ 5min
95℃ 30s
53℃ 40s
72℃ 1min
2 to 5 24循环，总计25循环
72℃ 8min
15℃ forever
一般用M13引物扩增获得和目的片段大小接近的菌液，还需要用原有的特异条带进行扩增验证，只有两个PCR都获得和目的片段大小接近的条带，才能证实菌液中细菌携带的是我们所需要的片段，而不是其他片段。
一般菌液送测体积在150-300μL之间，不能全送，以备测序过程中发生意外情况，如某段时间某公司老是说菌液送到公司的时候冻死。
一般菌液测序花费的时间在3天左右，也就是说周一送样，周四能知道测序结果，如果测序结果满意，则说明克隆成功，如果测序结果不满意，则需要好好分析一下实验过程。
下面是一个实验室最简单的克隆步骤，本人只做过1次，效果还可以
1. 16℃连接 30min
2. 取3μL连接液加入30μL感受态细胞中，冰浴30min
3. 42℃热激45s，冰浴1min
4. 加入300μL LB培养基 37℃ 250转 60min
5. 涂平板，37℃正置20min后，倒置过夜
6. 4度冰箱放置1小时，挑克隆，菌落PCR
原文在本人QQ空间可查，需要的同学可以给我发站内信。
