我试过了！喷血推荐blue sliver胶体考染法！
丁香园
2213
喷血推荐blue sliver胶体考染法！
我做了2D的三块平行胶，一个一般考染，一个blue sliver，一个银染（如图从左到右），
我想不用我多解释什么了吧？！！
愿意喷血向大家汇报这种染色方法的初步尝试结果和经验！！
一、先讲讲本版对这种染色方法的提出和进一步讨论过程：
1、siashq大侠在“请教：2DE考染的困惑”
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1253068&sty=1&tpg=2&age=0
中提出银染灵敏度高，但质谱鉴定成功率低；而考染质谱鉴定成功率高，但灵敏度不够；好多地方只接受考染标本质谱。
这也是所有做2D――质谱人的困惑，一些更有意义的蛋白质往往是一些低丰度蛋白质，做分析型2D的银染，发现一些低丰度蛋白质，可是做制备型考染时往往灵敏度不够，检测不到。
之后，yezi0623大侠首先提到“electrophoresis杂志2004年25卷1237页的方法，戏称blue silver！”；然后jnuxz主任大人，为我们提供了全文。可是全文只给了配方并没有给出详细步骤。
siashq大侠通过给作者写信，最终确定步骤为：
fix : 40 % ethanol + 10 % acetic acid 30min;
wash: distilled water 15min * 4change;
staining: (0.12% CBB G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) overnight
destain: distilled water
之后，czlong2008大侠，另开新贴，
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1333143&sty=1&tpg=1&age=0
翻译提供了具体染液配制方法，dodderzhang大侠和dodogougou大侠尝试了SDS PAGE胶的这种染色方法，于是我就心动了！！也想象原文一样做三块2D胶，试一把。
讲心里话，这种方法完全是在本版大家热烈讨论和互相交流之下而成型的，我由衷的感谢丁香园，感谢上面的这些战友。现在我尝试了，而且算是初步做成了，我愿意把我做的步骤、改进和体会介绍给大家。
二、步骤：
原文的步骤见zhaolsina大虾的下面回帖（热心同志，主任加分呀！），另外为什么用G250不用R250zhaolsina大虾也为大家说明了。
1、染液配制：染色液的成份（0.12% G-250, 10%（NH4）2SO4，10% H3PO4，20%甲醇）
100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g 粉末状（NH4）2SO4（边搅拌，边加）先溶解,然后加入 1.2g G-250 再溶解（其实不能真正溶解），用水定容到800ml ，边搅拌边加入200ml甲醇，终体积1000ml（可保存至少半年）。
2、染色
固定: 40 % 甲醇 + 10 % 乙酸 30min或过夜;
水洗: 去离子水 15min × 4;
染色: (0.12% G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) 过夜
3、脱色: 去离子水至背景清楚
三、经验和体会
1、 关于试剂，我用的G250是fisher原装的，硫酸氨是国产的（没时间买进口的，建议大家用进口的），磷酸、醇是国产分析纯（85％），
2、 关于配液
（NH4）2SO4要边搅拌，边加，否则容易结成大块而且很硬很难溶，就这样也不能完全溶解，好像液体已经饱和了。
G250好像在开始加到硫酸氨溶液时也不能真正溶解，只是形成混悬状态。
到最后加入甲醇之后还要搅拌好久，才可以部分真正溶解。
3、 关于改进之处：
我把甲醇改成乙醇，发现好多考染方法用乙醇替代甲醇，另外我的硫酸氨用的国产的，来不及买进口的，估计进口的效果会更好。国产的好难溶。
4、发现脱色有点难，脱干净背景用水要换5、6次，1。5到2个小时。好像背景还有些发蓝，不能真正脱干净。
5、灵敏度确实有很大提高，不过是否真的能够达到ng级就不知道了。
四、关于后续的酶切（原文）：
The gel discs containing the protein of interest were washed twice with 50% ACN ＋ 50% ammonium bicarbonate (5 mM solution)，for a minimum of 2–3 h untill full decoloration of the gel. After that, wash twice (10 min each time) in 100% ACN. In-gel digestion was carried out in 100 mM ammonium bicarbonate, 1 mM CaCl2 pH 8.9, 30% ACN, and 12.5 ng/mL (1 mg) sequencing grade modified trypsin (Promega, Madison, WI, USA) overnight at 37 C.
五、存在的问题：
1、为什么要先用一部分水溶解硫酸氨和R250，之后再加水和醇？而不是一起加，尤其是水，发现100ml水溶100g硫酸氨好难，多加点水可不可以？
2、用乙醇代替甲醇在这种方法里到底合适不合适？？谁有兴趣比较一下？
3、我是拿分析纯85％的磷酸当100％的来配液体的，这样对不对？是否换算之后再配（那样水会加的更少，硫酸氨更难溶）？好像没有纯磷酸，最高85％。
4、 关于脱色遇到的问题，大家有什么实践经验或者高见？？
5、siashq大侠也做了三种方法的比较，还有谁做过？或者将来做了，欢迎大家交流经验、讨论下去。
(注：附原文）
我做了2D的三块平行胶，一个一般考染，一个blue sliver，一个银染（如图从左到右），
我想不用我多解释什么了吧？！！
愿意喷血向大家汇报这种染色方法的初步尝试结果和经验！！
一、先讲讲本版对这种染色方法的提出和进一步讨论过程：
1、siashq大侠在“请教：2DE考染的困惑”
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1253068&sty=1&tpg=2&age=0
中提出银染灵敏度高，但质谱鉴定成功率低；而考染质谱鉴定成功率高，但灵敏度不够；好多地方只接受考染标本质谱。
这也是所有做2D――质谱人的困惑，一些更有意义的蛋白质往往是一些低丰度蛋白质，做分析型2D的银染，发现一些低丰度蛋白质，可是做制备型考染时往往灵敏度不够，检测不到。
之后，yezi0623大侠首先提到“electrophoresis杂志2004年25卷1237页的方法，戏称blue silver！”；然后jnuxz主任大人，为我们提供了全文。可是全文只给了配方并没有给出详细步骤。
siashq大侠通过给作者写信，最终确定步骤为：
fix : 40 % ethanol + 10 % acetic acid 30min;
wash: distilled water 15min * 4change;
staining: (0.12% CBB G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) overnight
destain: distilled water
之后，czlong2008大侠，另开新贴，
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=1333143&sty=1&tpg=1&age=0
翻译提供了具体染液配制方法，dodderzhang大侠和dodogougou大侠尝试了SDS PAGE胶的这种染色方法，于是我就心动了！！也想象原文一样做三块2D胶，试一把。
讲心里话，这种方法完全是在本版大家热烈讨论和互相交流之下而成型的，我由衷的感谢丁香园，感谢上面的这些战友。现在我尝试了，而且算是初步做成了，我愿意把我做的步骤、改进和体会介绍给大家。
二、步骤：
原文的步骤见zhaolsina大虾的下面回帖（热心同志，主任加分呀！），另外为什么用G250不用R250zhaolsina大虾也为大家说明了。
1、染液配制：染色液的成份（0.12% G-250, 10%（NH4）2SO4，10% H3PO4，20%甲醇）
100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g 粉末状（NH4）2SO4（边搅拌，边加）先溶解,然后加入 1.2g G-250 再溶解（其实不能真正溶解），用水定容到800ml ，边搅拌边加入200ml甲醇，终体积1000ml（可保存至少半年）。
2、染色
固定: 40 % 甲醇 + 10 % 乙酸 30min或过夜;
水洗: 去离子水 15min × 4;
染色: (0.12% G250 , 10% ammonium sulfate, 10% phosphoric acid and 20% methanol) 过夜
3、脱色: 去离子水至背景清楚
三、经验和体会
1、 关于试剂，我用的G250是fisher原装的，硫酸氨是国产的（没时间买进口的，建议大家用进口的），磷酸、醇是国产分析纯（85％），
2、 关于配液
（NH4）2SO4要边搅拌，边加，否则容易结成大块而且很硬很难溶，就这样也不能完全溶解，好像液体已经饱和了。
G250好像在开始加到硫酸氨溶液时也不能真正溶解，只是形成混悬状态。
到最后加入甲醇之后还要搅拌好久，才可以部分真正溶解。
3、 关于改进之处：
我把甲醇改成乙醇，发现好多考染方法用乙醇替代甲醇，另外我的硫酸氨用的国产的，来不及买进口的，估计进口的效果会更好。国产的好难溶。
4、发现脱色有点难，脱干净背景用水要换5、6次，1。5到2个小时。好像背景还有些发蓝，不能真正脱干净。
5、灵敏度确实有很大提高，不过是否真的能够达到ng级就不知道了。
四、关于后续的酶切（原文）：
The gel discs containing the protein of interest were washed twice with 50% ACN ＋ 50% ammonium bicarbonate (5 mM solution)，for a minimum of 2–3 h untill full decoloration of the gel. After that, wash twice (10 min each time) in 100% ACN. In-gel digestion was carried out in 100 mM ammonium bicarbonate, 1 mM CaCl2 pH 8.9, 30% ACN, and 12.5 ng/mL (1 mg) sequencing grade modified trypsin (Promega, Madison, WI, USA) overnight at 37 C.
五、存在的问题：
1、为什么要先用一部分水溶解硫酸氨和R250，之后再加水和醇？而不是一起加，尤其是水，发现100ml水溶100g硫酸氨好难，多加点水可不可以？
2、用乙醇代替甲醇在这种方法里到底合适不合适？？谁有兴趣比较一下？
3、我是拿分析纯85％的磷酸当100％的来配液体的，这样对不对？是否换算之后再配（那样水会加的更少，硫酸氨更难溶）？好像没有纯磷酸，最高85％。
4、 关于脱色遇到的问题，大家有什么实践经验或者高见？？
5、siashq大侠也做了三种方法的比较，还有谁做过？或者将来做了，欢迎大家交流经验、讨论下去。
(注：附原文）
