人集落刺激因子GCSF的工业生产工艺
丁香园论坛
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首先申明：
这是一个非常成功的工业化规模从包含体生产集落刺激因子的工艺，价值连城。
比现在的，比如张江的XX公司的柱上复性，以及西北工大的耿老师的色谱饼工艺好得多，方便得多，产率高得多。希望有有心人关注，不为啥，为中国的患者，成本这么低，却卖。。。。，二为给各位提供包含体复性研究的参考。。。 闲话不说。
集落刺激因子的基因构建、表达是非常容易的，在上海花个万把快钱就可以搞定。原核做包含体表达，各种表达载体都行，小菜一碟。
最大的问题是如何复性。以下是经试验验证的工艺：
1、破细胞
可以考虑高压匀浆机，这样效率高些。当然超声也性。
2、洗涤包含体
4M以下尿素洗涤，缓冲液等文献上到处都是。
3、裂解
8M尿素裂解，不可以用盐酸胍。这是理论加经验。记住XXX，DTT一定要加。
上述三步，无话。看文献。
4、复性
有公司用柱上复性，如用G25等，其实根本不必，直接稀释复性就行了。
复性体系：这是关键，可以是最大的诀窍。
氧化还原体系：加入氧化型谷光甘肽，比例不合适，复性效率很差。这个比例受裂解液加入带入的DTT的影响。在不同的试验室可能稍有差异。
可以做个摸索试验，以上柱子后目标蛋白和杂质的多少来判定合适比例。
复性浓度：文献中都建议稀释复性时浓度小于0.1mg/ml，其实这是总体上的经验。要具体问题具体分析，对于集落刺激因子，这个浓度可以上升到0.Xmg/ml，浓度提高对以后的纯化大有好处。
复性液尿素浓度：需含0.X到0XM的尿素，这可以通过调节裂解液蛋白浓度中加入。
复性时间：过夜即可。
5、蛋白纯化
5.1 疏水层析
复性结束后，体积可能达到几十升，好像很恐怖，其实根本不必害怕，上个疏水层析就可以了。
填料可以采用GE的苯基柱，低取代高取代都性，但GE填料太软，容易塌掉，可以考虑用点硬的介质。大有公司650M介质不错，不过价格似乎要贵些。反正可以多次用，就不要介意了。
柱子用多大呢。记住，每毫升填料可以吸附20mg以上，但不要让它都”吃饱“了，吃个10-20毫克就行了。这样用1升左右的柱子可以吸附10克以上。
市场上一支可是不到1毫克，几十元。当然那是制剂了。
加盐加硫酸铵，加多少浓度呢，可以摸索一下。不要超过X。xM，同时要加入XXXX。
下一步就是洗脱了，疏水洗脱就是降低盐浓度，洗脱浓度为0.X的硫酸铵，pHX
经过这一步后，GCSF的纯度可以接近90%，活力达到药典要求。
5.2 缓冲液置换
为了进行下一步离子交换，进行缓冲液置换。
用GE公司G25,不要吝惜填料，买一个500克包装，几千元，装一个脱盐柱，实验室里受用无穷。
缓冲液为醋酸缓冲液，50mM就行，pH=x.X
5.3 离子交换层析
这一步的主要目的是除去核算等低pH等电点物质，其次是浓缩。
上柱结束后，用0.xM的醋酸缓冲液洗涤，然后XXM醋酸缓冲液洗脱。
洗脱纯度应该大于98%
按上述工艺一批可以生产5-10克集落刺激因子。
卖原料非法，但是确实有人10-20万一克的卖罗。
如果是蛋白纯化人士，有上述步骤介绍，应该可以很快重复，但。。。就得。。。不好说。
虽无具体数据，但从中可以看出其原理与过程，为别的工艺开发带来参考。
加入有需要具体数据的，给留个条。
这是一个非常成功的工业化规模从包含体生产集落刺激因子的工艺，价值连城。
比现在的，比如张江的XX公司的柱上复性，以及西北工大的耿老师的色谱饼工艺好得多，方便得多，产率高得多。希望有有心人关注，不为啥，为中国的患者，成本这么低，却卖。。。。，二为给各位提供包含体复性研究的参考。。。 闲话不说。
集落刺激因子的基因构建、表达是非常容易的，在上海花个万把快钱就可以搞定。原核做包含体表达，各种表达载体都行，小菜一碟。
最大的问题是如何复性。以下是经试验验证的工艺：
1、破细胞
可以考虑高压匀浆机，这样效率高些。当然超声也性。
2、洗涤包含体
4M以下尿素洗涤，缓冲液等文献上到处都是。
3、裂解
8M尿素裂解，不可以用盐酸胍。这是理论加经验。记住XXX，DTT一定要加。
上述三步，无话。看文献。
4、复性
有公司用柱上复性，如用G25等，其实根本不必，直接稀释复性就行了。
复性体系：这是关键，可以是最大的诀窍。
氧化还原体系：加入氧化型谷光甘肽，比例不合适，复性效率很差。这个比例受裂解液加入带入的DTT的影响。在不同的试验室可能稍有差异。
可以做个摸索试验，以上柱子后目标蛋白和杂质的多少来判定合适比例。
复性浓度：文献中都建议稀释复性时浓度小于0.1mg/ml，其实这是总体上的经验。要具体问题具体分析，对于集落刺激因子，这个浓度可以上升到0.Xmg/ml，浓度提高对以后的纯化大有好处。
复性液尿素浓度：需含0.X到0XM的尿素，这可以通过调节裂解液蛋白浓度中加入。
复性时间：过夜即可。
5、蛋白纯化
5.1 疏水层析
复性结束后，体积可能达到几十升，好像很恐怖，其实根本不必害怕，上个疏水层析就可以了。
填料可以采用GE的苯基柱，低取代高取代都性，但GE填料太软，容易塌掉，可以考虑用点硬的介质。大有公司650M介质不错，不过价格似乎要贵些。反正可以多次用，就不要介意了。
柱子用多大呢。记住，每毫升填料可以吸附20mg以上，但不要让它都”吃饱“了，吃个10-20毫克就行了。这样用1升左右的柱子可以吸附10克以上。
市场上一支可是不到1毫克，几十元。当然那是制剂了。
加盐加硫酸铵，加多少浓度呢，可以摸索一下。不要超过X。xM，同时要加入XXXX。
下一步就是洗脱了，疏水洗脱就是降低盐浓度，洗脱浓度为0.X的硫酸铵，pHX
经过这一步后，GCSF的纯度可以接近90%，活力达到药典要求。
5.2 缓冲液置换
为了进行下一步离子交换，进行缓冲液置换。
用GE公司G25,不要吝惜填料，买一个500克包装，几千元，装一个脱盐柱，实验室里受用无穷。
缓冲液为醋酸缓冲液，50mM就行，pH=x.X
5.3 离子交换层析
这一步的主要目的是除去核算等低pH等电点物质，其次是浓缩。
上柱结束后，用0.xM的醋酸缓冲液洗涤，然后XXM醋酸缓冲液洗脱。
洗脱纯度应该大于98%
按上述工艺一批可以生产5-10克集落刺激因子。
卖原料非法，但是确实有人10-20万一克的卖罗。
如果是蛋白纯化人士，有上述步骤介绍，应该可以很快重复，但。。。就得。。。不好说。
虽无具体数据，但从中可以看出其原理与过程，为别的工艺开发带来参考。
加入有需要具体数据的，给留个条。
