软琼脂集落形成实验

软琼脂集落形成实验可用于非锚着依赖性生长的细胞进行集落生成。

器材：

① HeLa 细胞

② 细胞计数板

③ 60 mm 培养皿

④ 10 mL 移液管

⑤ 小烧杯

⑥ 10 mL 吸管橡皮头

⑦ 超净工作台

⑧ 37 ℃ CO₂ 孵箱

⑨ 倒置相差显微镜离心机

⑩ 水浴锅。

试剂:

① RPMI-1640 培养液

② 胎牛血清

③ 0.25％ 胰蛋白酶

④ 吉姆萨染液

⑤ 琼脂

软琼脂集落形成实验基本过程可分为以下几步：

A. 消毒

B. 培养液与消化液在 37 ℃ 恒温箱内预热。

C. 细胞悬液制备，取对数生长期细胞，用 0.25％ 胰蛋白酶消化，吹打形成单细胞悬液。1000 r/min 离心 8 min，弃上清液，用含 10％ 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞重新悬浮。在计数板上计数细胞，并用培养基调整细胞浓度，以备使用。

D. 制备半固体琼脂，分为底层和上层。

底层琼脂：称取琼脂 0.25 g，加入双蒸水 32 mL，高压灭菌后冷却至 50 ℃，依次加入 50 ℃ 预热的 5 倍浓缩的 RPMI-1640 培养基 8 mL、小牛血清 10 mL、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 μg/mL、8％ NaHCO₃ 0.2 mL，混匀后分装于 60 mm 培养皿中，每皿加入 3 mL，水平放置，室温冷却凝固。

上层琼脂：称取琼脂 0.15 g，加入双蒸水 32 mL，高压灭菌后冷却至 40 ℃，依次加入成分同上，混匀后置于 40 ℃ 水浴中保温，防止凝固。

E. 将细胞浓度调整到 10⁵ 个/mL。

F. 取 0.1 mL 细胞悬液，加入到 5 mL 40 ℃ 的上层琼脂液中，混匀后迅速取 0.5 mL 加入到铺有底层琼脂的培养皿中，在室温下水平放置 10 min，待上层琼脂凝固后移入 CO₂ 孵箱，在 37 ℃ 下培养 2～3 周。上层琼脂中细胞最终浓度为 2000 个/mL。

1. 细胞悬液中单个分散细胞应多于 90％。

2. 软琼脂培养时，注意在琼脂与细胞混合时温度不要超过 40 ℃，以免烫伤细胞。

3. 接种细胞密度不宜过高。