简介
平板克隆法集落形成实验主要用于可检测贴壁细胞细胞的克隆形成能力。
原理
平板克隆细胞集落形成实验的原基本理是利用平板作为培养基质，在单个细胞在体外持续增殖 6 代以上，其后代形成一个细胞群体，称为集落。
每个克隆均包含 50 个细胞以上，大小在 0.3～1.0 mm 之间。通过计算集落形成率，来测定测试细胞的增殖能力。
材料与仪器
器材：
① HeLa 细胞
② 细胞计数板
③ 60 mm 培养皿
④ 10 mL 移液管
⑤ 小烧杯
⑥ 10 mL 吸管橡皮头
⑦ 超净工作台
⑧ 37 ℃ CO2 孵箱
⑨ 倒置相差显微镜离心机
⑩ 水浴锅。
试剂:
① RPMI-1640 培养液
② 胎牛血清
③ 0.25％ 胰蛋白酶
④ 吉姆萨染液。
步骤
平板克隆法集落形成实验基本过程可分为以下几步：
A. 消毒
B. 培养液与消化液在 37 ℃ 恒温箱内预热。
C. 细胞悬液制备，取对数生长期细胞，用 0.25％ 胰蛋白酶消化，吹打形成单细胞悬液。1000 r/min 离心 8 min，弃上清液，用含 10％ 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞重新悬浮。在计数板上计数细胞，并用培养基调整细胞浓度，以备使用。
D. 细胞接种，根据细胞增殖能力，将细胞悬液作梯度倍数稀释。一般以每皿含 100 个、200 个细胞的细胞浓度，将细胞悬液接种于消毒好的培养皿中，然后轻轻晃动培养皿使细胞分散均匀。
E. 培养，将平皿移入 CO2 孵箱，在 37 ℃、5％ CO2 以及饱和湿度环境下，静止培养 2～3 周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
F. 染色，弃培养液，用 PBS（0.01 mol/L，pH7.4）小心浸洗 2 次。加固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1）固定 15 min。弃固定液，晾干后用吉姆萨染液染色 10 min，然后用流水缓慢冲洗，空气干燥。
注意事项
1. 细胞悬液中单个分散细胞应多于 90％。
2. 平板培养早期尽量不要晃动培养皿，以免细胞脱落，导致实验误差增加。
3. 平板培养期间应及时更换新鲜培养基，保持培养物获得充分的营养成分。
4. 接种细胞密度不宜过高。
来源：丁香实验
