细胞的集落形成实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

造血生长因子是一类主要作用于造血系统的细胞因子的总称。造血细胞的存活、增殖及分化离不开造血微环境中的造血生长因子。

因此，在研究造血过程时，对造血生长因子的检测是必不可少的。集落形成实验同 ELISA 及细胞增殖实验相比较，不但能反映细胞因子水平，还能反映不同生长因子对集落形成类别的影响。

材料与仪器

器材：

① 35 mm 细胞培养皿（悬浮细胞用）

② 10 cm 细胞培养皿

③ 手术器械

④ 1 mL 注射器

试剂：

① 甲基纤维素半固体培养基 MethoCult（Stem Cell Technology 03334）;

② 1x PBS（NaCl 137 mmol/L，KCI 2.7 mmol/L，Na₂HPO，10 mmol/L。

步骤

细胞的集落形成实验的基本过程可分为如下几步：

A 无菌条件下收获胎肝细胞并用注射器分离成单细胞悬液。

B 细胞计数。

C 按照最终细胞接种密度的 10x 浓度配制细胞悬液。

D 实验设置 2 个副孔的话，将 0.3 mL 细胞液和 3 mL 甲基纤维素培养基混匀。

E 每个 35 mm 培养皿分装 1.1 mL 甲基纤维素细胞培养液。

F 每个 10 cm 培养皿里放 2 个 35 mm 培养皿和一个不加盖子的 35 mm 培养皿。不加盖子的 35 mm 培养皿里加 3 mL 灭菌水，以保湿并减少污染的风险。

G 将培养皿置于 37 ℃，5％ CO₂，湿度＞95％。

H 对 CFU-E 而言，2 天后可以在显微镜下对造血克隆计数；对 BFU-E 而言，7～10 天后可以计数。

I 图 8-8-2 为各组织正常情况下的 BFU-E，CFU-GM，CFU-GEMM 的数目。

注意事项

1. 隔夜融化甲基纤维素培养基。

2. 无菌操作，试剂和耗材都应事先灭菌。

3. 也可以用磁珠或 FACS 分选等方法对细胞进行筛选后，再种植于甲基纤维素培养基上。

4. 为保持干＼祖细胞活性，整个操作过程应尽量快，以减少对细胞活性的损伤。

5. 可在甲基纤维素中加入不同的细胞因子，以检查干＼祖细胞向不同终末分化细胞分化的能力；StemCell Technologies 公司有加了不同生长因子的甲基纤维素培养基可供不同的实验目的。

6. 可以用 Benzidine 染色来帮助鉴别 BFU-E 和 CFU-E 克隆。

7. 图 8-8-1 显示了其他克隆的外形，以供鉴别。

来源：丁香实验