蛋白质分离纯化技术研究进展
丁香园论坛
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与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小，形状，溶解度，等电点，亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。与此相对应的分离纯化方法参见表1。从表1可看出，当前蛋白质的纯化主要是依靠层析和电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在，因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何一种蛋白质从复杂的混合物中分离出来，而只能依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序，以获得较高纯度的制品。
表1. 蛋白质物化性质和分离纯化方法
蛋白质的物理和化学性质 分离纯化方法
分子的大小和形状 密度梯度离心、超滤、透析，分子筛等
等电点和电荷 制备电泳、等电聚焦层析、离子交换层析、
吸附层析等
溶解度 盐溶、盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉
淀、液液萃取技术等
与其他分子的亲和性 亲和层析、金属螯合层析、共价层析等
亲疏水性 疏水层析、反相层析等
1. 扩张柱床吸附技术
当重组蛋白的表达为包涵体形式时，表达量高，是近年来热门的研究项目。但是包涵体需经过一个复杂的复性过程才可进行下一步的纯化工作。在复性过程中，溶液的体积放大了几十倍，同时还伴随有大量的不溶性悬浮物生成。当重组蛋白以分泌形式表达时，其发酵液中也存在着大量菌体碎片。这些含有不溶性悬浮物或菌体碎片的溶液的处理在传统工艺上都需要经过高速离心或者过滤。这不仅需要昂贵的离心设备，而且所费时间较长，往往成为基因工程产品下游工艺开发的限制瓶颈。最近问世的扩张柱床吸附层析技术(Expanded Bed Adsorption Chromatography Techniques)及时地为解决这一问题提供了新的途径。扩张柱床吸附层析技术操作原理与一般的吸附层析相似，层析柱经过自下而上的扩张及平衡后，含菌体的发酵液或复性液从柱底部进至柱中。此时目标蛋白会吸附于凝胶上面，一些杂蛋、菌体和不溶性的颗粒会随液流从柱顶流出，而不会阻塞其中。再通过改变洗脱条件，目标蛋白便可从柱中洗下来。选择性地利用介质的性质，再加上合适的缓冲液和洗脱条件，产品可以进行一步澄清浓缩纯化。这不仅减少了样品预处理的损失，样品体积也不再是处理量的限制因素，在缩短纯化步骤的同时，省去了大笔去购买大处理量的高速离心机及大规模膜过滤和超滤系统的经费。由此可见，扩张柱床吸附层析技术针对基因工程产品，结合了澄清、浓缩及产品捕捉三个步骤为一体，突破性地直接从未经任何预处理的样品中捕获靶蛋白，极大地减少了损失，降低了生产成本，提高了经济效益。
2. 径向膜层析技术
传统的层析技术往往采用长轴流向设计，虽然为广大的科技工作者运用，但依然存在许多缺点: (1) 流速较慢，层析耗时长效率低；(2) 层析过程中压降较大，增加了对设备的要求；(3) 层析条件不易放大，若想放大规模，需重新摸索分离条件，为重组蛋白的大规模分离纯化提出了难题。80年代中期国际上提出了一种称为径向层析(Radial Flow Chromatography)的新技术。80年代后期，径向层析又结合膜分离处理量大的优点，发展成径向膜层析技术，在原理上解决了上述问题。径向膜层析柱常采用螺旋卷式膜组件结构，流动的方向是从层析柱的圆周流向柱的圆心，即径向流动。由于这一原理，与传统的轴向层析柱相比，径向层析有以下几个优点: (1) 流向的截面积加大，即使在流速高时压降仍很低，因而纯化速度快处理量大。(2) 保持柱径不变，无需改变其它分离条件，仅增加柱长就可以增加上样量，因而有利于放大生产。
3. 灌注层析技术
液相层析技术是生物分子分离纯化的重要工具，而其中分离介质尤为重要。在过去几十年里，人们一直在提高液相层析的分离能力，以达到最好的分离效果。谱带扩展是影响层析效率的主要因素之一，它主要源于流动相的粒子内部扩散、纵向扩散和溶质扩散这3个因子，影响了固定相和流动相之间的传质和交换平衡速度。通常人们解决这一问题的方法是减小介质颗粒的大小。比如介质Mini系列和Mono系列就是采用这一策略，显著地提高了层析柱床的分辨效率。然而当颗粒达到3～5μｍ时，再提高分辨率就不太实际了。1989年初美国的Dr. Frederick Regnier、Dr. Noubar Afeyan等人率先发明了具有贯穿孔的分离载体———POROS，同时他们将液流通过这一载体而减小粒子内部扩散的层析行为命名为灌注层析技术(Perfusion Chromatography)。这一技术的提出为流动相于固定相的传质问题的解决提供了新的方法。POROS介质是在苯乙烯、二乙烯苯的交联共聚物基础上构成的，其化学稳定性和机械强度均高于传统的葡聚糖、聚丙烯酸酯和硅胶等介质。POROS为双模式网孔结构，在介质上有600～800nm的贯穿孔和与之相连接的80～150nm扩散孔。这一结构可以容许液体对流到分离介质的内表面，加快了流动相与固定相的传质速度，缩短了交换平衡所需的时间。因此这一方法打破了传统的流速、分辨率和容量之间的三角关系，即在流速增加的情况下柱容量和分辨率均不会降低，且反压也不会升高，为快速纯化生物大分子提供了基础。
由于灌注层析技术的原理只是增强了传质的动力学过程而不改变层析的分离原理，因此它可以运用于除凝胶排阻层析之外的所有层析技术中。鉴于灌注层析技术的快速高效性能，它的推广是蛋白质纯化技术发展的必然趋势。
4. 置换层析技术
置换层析(Displacement Chromatography)是非线形层析技术中(即被分离的物质在流动相与固定相之间不是线性关系而是呈其它函数关系)唯一可实际应用的技术，其基本原理是利用置换剂置换出吸附在层析柱的被分离组分。置换层析与传统洗脱层析都是利用样品组分对固定相的亲和能力不同将各组分分离，但两者的工作原理却大相径庭。传统的洗脱层析是由于各分离组分在流动相与固定相之间的分配平衡常数不同而引起的各组分在流动相的迁移速度不同达到分离目的。而置换层析的分离原理是被吸附的各组分对固定相吸附部位的直接竞争作用的结果，依据与固定相的亲和性不同在置换剂的推动下，形成一系列已分离的置换序列。置换层析与传统洗脱层析的比较见表2。重组蛋白质的纯化经常会遇到如下问题，即虽经过多次不同层析技术的分离，目标蛋白中仍有无法去除的杂蛋白，这些杂蛋白在分子量大小和所带电荷数均极为相似，有的甚至就是目标蛋白的折叠异构物。因而极难除去，常令纯化工作者头疼。利用置换层析这一具有高分辨率的方法常常可以起到特殊的效果。1997年，Amitava Kunda和Steven Camer报道利用小分子量的置换剂将离子交换层析和分子筛层析不能分离的牛细胞色素Ｃ和马细胞色素Ｃ完全分开。此外，置换层析的另一大优点是在如此高的分辨率的情况下依然保持很高的上样量，这无疑为重组蛋白的生产提供了有效的手段。
表2. 置换层析与传统洗脱层析的比较
置换层析 传统洗脱层析
分离机理 被吸附组分之间对 吸附的平衡常数不同导致各
固定相亲和性大小不同 组分在流动相中有不同的速度
洗脱峰形 矩形的平台洗脱峰形 钟罩形洗脱峰形
上样量 饱和吸附量的40%～60% 饱和吸附量的5%
样品在洗 浓缩状态分离 稀释状态分离
脱后的浓度
有无拖尾 无 有
分辨率 极高 高
诚然，目前置换层析也有许多局限性:(1)由于置换层析技术要求被分离蛋白质附和Langmuir吸附等温线，如不同蛋白在同一吸附剂上的等温线有交叉时，置换层析的分离效率就会大打折扣。(2)由于在分离过程中各组分形成相互接近的的置换序列，就会在彼此相邻的交界处发生洗脱峰的重叠现象，影响样品的回收率。(3)由于置换层析中的浓缩作用，许多蛋白质在超过一定浓度的界限时会聚集形成沉淀，造成层析柱堵塞。
鉴于置换层析技术的上述特点，国内外许多学者都认为它将成为基因工程下游技术中最有效的制备性生物物质分离技术之一。今后的研究工作将会集中在不断探索研制低价无毒而高效蛋白质置换剂，适合置换层析技术的新型吸附材料上。
5. 金属螯合亲和层析的新运用
目前金属螯合亲和层析(Metal Chelate Affinity Chromatography)所采用的螯合剂主要有两种:一是亚氨基二乙酸(IDA)，另一个是次氨基三乙酸(NTA)。它们都可以有效地与Ni、Zn、Cu和Co等二价金属离子发生螯合作用，从而将金属离子牢固地结合在介质上。在层析过程中，这些二价金属离子又可以螯合溶液中蛋白质分子外露的组氨酸等氨基酸残基簇，将蛋白吸附在介质上。洗脱时，通过改变ｐＨ，加竞争的螯合试剂等方法，依据各蛋白组分与介质的亲和程度不同将目标蛋白与杂蛋白分离。因此具有分辨率高选择性好的特点，给分离蛋白质带来了很大方便。金属螯合亲和层析的另一个优点是层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化又可以应用于含6M盐酸胍或8M尿素的变性条件。这一优点尤其对以包涵体形式表达的重组蛋白纯化尤为有利。但是在实际应用过程中金属螯合亲和层析也遇到一些问题。在过去，金属螯合亲和层析填料大都采用琼脂糖为介质，而琼脂糖颗粒表面较为粗糙，容易产生一些非特异性吸附现象。这一现象尤其出现在小量蛋白的分离或含疏水性蛋白多的情况中，而且也不适应快速分离蛋白，大大影响了金属螯合层析的分离效果。针对这一情况，90年代以来国外的一些科学家采用磁化或超顺磁化介质克服了这一缺点。含有氧化铁的交联琼脂糖是常用的磁化填料，它们的颗粒非常细，表面极其光滑，将蛋白的非特异吸附降到最低的水平。
近年来，人们还将基因重组技术与金属螯合层析结合起来，在基因水平上为蛋白质的分离纯化提供方便。其基本原理是在目的基因的Ｎ端或Ｃ端加上6个His，这样表达出的蛋白就可以直接用于金属螯合层析当中。目前一些公司已推出商品化的试剂盒，美国Qiagen公司提供的QIA express系统就是很好的一例。该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等成分，可以将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的产物可直接用金属螯合层析进行分离，有时可取得一步纯化的效果。依据蛋白质空间结构，从基因水平考虑重组蛋白的纯化为今后蛋白质分离纯化途径提供了新的思路和方向。也有些公司根据抗体与抗原的亲和作用，将抗原与目的蛋白组成的融合蛋白表达，再利用结合抗体的亲和柱分离目标蛋白也取得同样好的效果。
表1. 蛋白质物化性质和分离纯化方法
蛋白质的物理和化学性质 分离纯化方法
分子的大小和形状 密度梯度离心、超滤、透析，分子筛等
等电点和电荷 制备电泳、等电聚焦层析、离子交换层析、
吸附层析等
溶解度 盐溶、盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉
淀、液液萃取技术等
与其他分子的亲和性 亲和层析、金属螯合层析、共价层析等
亲疏水性 疏水层析、反相层析等
1. 扩张柱床吸附技术
当重组蛋白的表达为包涵体形式时，表达量高，是近年来热门的研究项目。但是包涵体需经过一个复杂的复性过程才可进行下一步的纯化工作。在复性过程中，溶液的体积放大了几十倍，同时还伴随有大量的不溶性悬浮物生成。当重组蛋白以分泌形式表达时，其发酵液中也存在着大量菌体碎片。这些含有不溶性悬浮物或菌体碎片的溶液的处理在传统工艺上都需要经过高速离心或者过滤。这不仅需要昂贵的离心设备，而且所费时间较长，往往成为基因工程产品下游工艺开发的限制瓶颈。最近问世的扩张柱床吸附层析技术(Expanded Bed Adsorption Chromatography Techniques)及时地为解决这一问题提供了新的途径。扩张柱床吸附层析技术操作原理与一般的吸附层析相似，层析柱经过自下而上的扩张及平衡后，含菌体的发酵液或复性液从柱底部进至柱中。此时目标蛋白会吸附于凝胶上面，一些杂蛋、菌体和不溶性的颗粒会随液流从柱顶流出，而不会阻塞其中。再通过改变洗脱条件，目标蛋白便可从柱中洗下来。选择性地利用介质的性质，再加上合适的缓冲液和洗脱条件，产品可以进行一步澄清浓缩纯化。这不仅减少了样品预处理的损失，样品体积也不再是处理量的限制因素，在缩短纯化步骤的同时，省去了大笔去购买大处理量的高速离心机及大规模膜过滤和超滤系统的经费。由此可见，扩张柱床吸附层析技术针对基因工程产品，结合了澄清、浓缩及产品捕捉三个步骤为一体，突破性地直接从未经任何预处理的样品中捕获靶蛋白，极大地减少了损失，降低了生产成本，提高了经济效益。
2. 径向膜层析技术
传统的层析技术往往采用长轴流向设计，虽然为广大的科技工作者运用，但依然存在许多缺点: (1) 流速较慢，层析耗时长效率低；(2) 层析过程中压降较大，增加了对设备的要求；(3) 层析条件不易放大，若想放大规模，需重新摸索分离条件，为重组蛋白的大规模分离纯化提出了难题。80年代中期国际上提出了一种称为径向层析(Radial Flow Chromatography)的新技术。80年代后期，径向层析又结合膜分离处理量大的优点，发展成径向膜层析技术，在原理上解决了上述问题。径向膜层析柱常采用螺旋卷式膜组件结构，流动的方向是从层析柱的圆周流向柱的圆心，即径向流动。由于这一原理，与传统的轴向层析柱相比，径向层析有以下几个优点: (1) 流向的截面积加大，即使在流速高时压降仍很低，因而纯化速度快处理量大。(2) 保持柱径不变，无需改变其它分离条件，仅增加柱长就可以增加上样量，因而有利于放大生产。
3. 灌注层析技术
液相层析技术是生物分子分离纯化的重要工具，而其中分离介质尤为重要。在过去几十年里，人们一直在提高液相层析的分离能力，以达到最好的分离效果。谱带扩展是影响层析效率的主要因素之一，它主要源于流动相的粒子内部扩散、纵向扩散和溶质扩散这3个因子，影响了固定相和流动相之间的传质和交换平衡速度。通常人们解决这一问题的方法是减小介质颗粒的大小。比如介质Mini系列和Mono系列就是采用这一策略，显著地提高了层析柱床的分辨效率。然而当颗粒达到3～5μｍ时，再提高分辨率就不太实际了。1989年初美国的Dr. Frederick Regnier、Dr. Noubar Afeyan等人率先发明了具有贯穿孔的分离载体———POROS，同时他们将液流通过这一载体而减小粒子内部扩散的层析行为命名为灌注层析技术(Perfusion Chromatography)。这一技术的提出为流动相于固定相的传质问题的解决提供了新的方法。POROS介质是在苯乙烯、二乙烯苯的交联共聚物基础上构成的，其化学稳定性和机械强度均高于传统的葡聚糖、聚丙烯酸酯和硅胶等介质。POROS为双模式网孔结构，在介质上有600～800nm的贯穿孔和与之相连接的80～150nm扩散孔。这一结构可以容许液体对流到分离介质的内表面，加快了流动相与固定相的传质速度，缩短了交换平衡所需的时间。因此这一方法打破了传统的流速、分辨率和容量之间的三角关系，即在流速增加的情况下柱容量和分辨率均不会降低，且反压也不会升高，为快速纯化生物大分子提供了基础。
由于灌注层析技术的原理只是增强了传质的动力学过程而不改变层析的分离原理，因此它可以运用于除凝胶排阻层析之外的所有层析技术中。鉴于灌注层析技术的快速高效性能，它的推广是蛋白质纯化技术发展的必然趋势。
4. 置换层析技术
置换层析(Displacement Chromatography)是非线形层析技术中(即被分离的物质在流动相与固定相之间不是线性关系而是呈其它函数关系)唯一可实际应用的技术，其基本原理是利用置换剂置换出吸附在层析柱的被分离组分。置换层析与传统洗脱层析都是利用样品组分对固定相的亲和能力不同将各组分分离，但两者的工作原理却大相径庭。传统的洗脱层析是由于各分离组分在流动相与固定相之间的分配平衡常数不同而引起的各组分在流动相的迁移速度不同达到分离目的。而置换层析的分离原理是被吸附的各组分对固定相吸附部位的直接竞争作用的结果，依据与固定相的亲和性不同在置换剂的推动下，形成一系列已分离的置换序列。置换层析与传统洗脱层析的比较见表2。重组蛋白质的纯化经常会遇到如下问题，即虽经过多次不同层析技术的分离，目标蛋白中仍有无法去除的杂蛋白，这些杂蛋白在分子量大小和所带电荷数均极为相似，有的甚至就是目标蛋白的折叠异构物。因而极难除去，常令纯化工作者头疼。利用置换层析这一具有高分辨率的方法常常可以起到特殊的效果。1997年，Amitava Kunda和Steven Camer报道利用小分子量的置换剂将离子交换层析和分子筛层析不能分离的牛细胞色素Ｃ和马细胞色素Ｃ完全分开。此外，置换层析的另一大优点是在如此高的分辨率的情况下依然保持很高的上样量，这无疑为重组蛋白的生产提供了有效的手段。
表2. 置换层析与传统洗脱层析的比较
置换层析 传统洗脱层析
分离机理 被吸附组分之间对 吸附的平衡常数不同导致各
固定相亲和性大小不同 组分在流动相中有不同的速度
洗脱峰形 矩形的平台洗脱峰形 钟罩形洗脱峰形
上样量 饱和吸附量的40%～60% 饱和吸附量的5%
样品在洗 浓缩状态分离 稀释状态分离
脱后的浓度
有无拖尾 无 有
分辨率 极高 高
诚然，目前置换层析也有许多局限性:(1)由于置换层析技术要求被分离蛋白质附和Langmuir吸附等温线，如不同蛋白在同一吸附剂上的等温线有交叉时，置换层析的分离效率就会大打折扣。(2)由于在分离过程中各组分形成相互接近的的置换序列，就会在彼此相邻的交界处发生洗脱峰的重叠现象，影响样品的回收率。(3)由于置换层析中的浓缩作用，许多蛋白质在超过一定浓度的界限时会聚集形成沉淀，造成层析柱堵塞。
鉴于置换层析技术的上述特点，国内外许多学者都认为它将成为基因工程下游技术中最有效的制备性生物物质分离技术之一。今后的研究工作将会集中在不断探索研制低价无毒而高效蛋白质置换剂，适合置换层析技术的新型吸附材料上。
5. 金属螯合亲和层析的新运用
目前金属螯合亲和层析(Metal Chelate Affinity Chromatography)所采用的螯合剂主要有两种:一是亚氨基二乙酸(IDA)，另一个是次氨基三乙酸(NTA)。它们都可以有效地与Ni、Zn、Cu和Co等二价金属离子发生螯合作用，从而将金属离子牢固地结合在介质上。在层析过程中，这些二价金属离子又可以螯合溶液中蛋白质分子外露的组氨酸等氨基酸残基簇，将蛋白吸附在介质上。洗脱时，通过改变ｐＨ，加竞争的螯合试剂等方法，依据各蛋白组分与介质的亲和程度不同将目标蛋白与杂蛋白分离。因此具有分辨率高选择性好的特点，给分离蛋白质带来了很大方便。金属螯合亲和层析的另一个优点是层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化又可以应用于含6M盐酸胍或8M尿素的变性条件。这一优点尤其对以包涵体形式表达的重组蛋白纯化尤为有利。但是在实际应用过程中金属螯合亲和层析也遇到一些问题。在过去，金属螯合亲和层析填料大都采用琼脂糖为介质，而琼脂糖颗粒表面较为粗糙，容易产生一些非特异性吸附现象。这一现象尤其出现在小量蛋白的分离或含疏水性蛋白多的情况中，而且也不适应快速分离蛋白，大大影响了金属螯合层析的分离效果。针对这一情况，90年代以来国外的一些科学家采用磁化或超顺磁化介质克服了这一缺点。含有氧化铁的交联琼脂糖是常用的磁化填料，它们的颗粒非常细，表面极其光滑，将蛋白的非特异吸附降到最低的水平。
近年来，人们还将基因重组技术与金属螯合层析结合起来，在基因水平上为蛋白质的分离纯化提供方便。其基本原理是在目的基因的Ｎ端或Ｃ端加上6个His，这样表达出的蛋白就可以直接用于金属螯合层析当中。目前一些公司已推出商品化的试剂盒，美国Qiagen公司提供的QIA express系统就是很好的一例。该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等成分，可以将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的产物可直接用金属螯合层析进行分离，有时可取得一步纯化的效果。依据蛋白质空间结构，从基因水平考虑重组蛋白的纯化为今后蛋白质分离纯化途径提供了新的思路和方向。也有些公司根据抗体与抗原的亲和作用，将抗原与目的蛋白组成的融合蛋白表达，再利用结合抗体的亲和柱分离目标蛋白也取得同样好的效果。
