蛋白质药品冷冻干燥过程中变性机理的研究进展

　在制造蛋白质类药物时,蛋白质分子受到物理或化学因素的影响,性质常有所改变,这类变化统称为变性。蛋白质在变性过程中,伴随有下列现象[ 1 ] : ① 生物活性的丧失; ② 一些侧链基团的暴露; ③ 一些物理化学性质的改变; ④ 生物化学性质的改变。为防止蛋白质变性,目前广泛应用的是冷冻干燥技术(freeze2drying) 。冷冻干燥技术是将含水物质在低温下冻结, 然后在真空条件下通过对冻干物料加热使冰升华,再除去物料中部分吸附水,得到干制品。用这种方法制造的药品所希望的特征是:结构稳定,生物活性基本不变,药物中的易挥发性成分和受热易变性成分损失很少,呈多孔状,药效好。然而冷冻干燥过程存在着一些潜在的损伤危险。在预冷、一次干燥、二次干燥和储存过程中,药品中的蛋白质可能存在一定程度的变性,因此必须弄清楚冷冻干燥过程中蛋白质的变性机理,以便制定可靠的冷冻干燥程序,采用优化的冷冻干燥过程,生产出高质量的药品。1 　蛋白质在冷冻干燥过程中的变性机理　　从二十世纪六、七十年代开始,国外一些学者对冷冻干燥蛋白质的变性机理进行了研究,当时认为蛋白质的变性主要发生在冷冻过程。Chilson 等[ 2 ] 认为冷冻过程中结晶引起溶剂水的状态和结构的变化是蛋白质变性的主要原因,并且蛋白质变性的程度依赖于冷冻的程度,冷冻温度越低,蛋白质变性越剧烈。有的研究者[ 3 ] 认为,在低温下有序的水的结构引起蛋白质分子中疏水键的破坏是导致蛋白质变性的主要原因。从二十世纪八、九十年代至今,普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质变性。Dean[ 4 ] 认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下,蛋白质将失去活性;而脱水过程本身能使蛋白质损伤,从而使复水后的蛋白质失去活性。关于蛋白质在冻结过程中变性的机理,大多数研究者认为蛋白质分子周围分布着多层水分子,在降温过程中,蛋白质分子周围的水分子不断冻结,但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结,则蛋白质就不会变性,反之,蛋白质就会变性。Hanafusa[ 5 ] 利用在冷冻干燥过程中比较稳定的卵清蛋白(ovalbumin) 和不稳定的肌球蛋白(myosin) 进行冷冻干燥对比实验,发现随着温度的降低,肌球蛋白中的未冻水含量逐渐降低,而卵清蛋白中的未冻水含量在低于0 ℃ 后开始下降,在-20 ℃～ -45 基本不变,温度低于-45 后,随着温度的降低,未冻水的含量又开始下降,从而认为在卵清蛋白温度从0 降到-20 的过程中,蛋白质分子周围的多层水分子冻结;温度从-20 降到-45 的过程中未冻水含量保持不变,在这段过程中,蛋白质表面覆盖着没有冻结的单层水分子,正是由于单层水分子的存在,才使蛋白质在冷冻过程中不发生变性作用。当温度低于-45 后,未冻水含量又开始降低,说明蛋白质表面的单层水分子开始冻结,蛋白质分子表面的氢键以及极性基团就会暴露在周围环境中而变性。在冷冻过程中没有变性的蛋白质,在干燥过程中也应保证蛋白质分子表面的单层水分子不受到破坏。因此在冷冻干燥蛋白质药物的过程中,一般要加入保护剂,防止由于蛋白质表面的单层水分子破坏而引起蛋白质的变性。
2 　保护剂在冷冻干燥过程中的作用
许多学者研究了保护剂对蛋白质的保护机理,认为在冷冻干燥过程中保护剂通过减少蛋白质中的结合水含量,并且加强蛋白质和剩余结合水分子之间的相互作用力来防止蛋白质变性[ 6 ] 。关于保护剂在冷冻干燥过程中使蛋白质保持稳定的机理目前有两种观点:一种认为具有粘性的保护剂包围在蛋白质分子的周围,阻止蛋白质的伸展和沉淀;另一种认为由于蛋白质分子中存在大量氢键,结合水通过氢键与蛋白质分子连结,当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后,保护剂能通过氢键与蛋白质分子相连,这样可保护氢键的连结位置不直接暴露在周围环境中,从而减少蛋白质的变性[ 7 ] 。对于上述两种观点,大多数研究者赞成后一种观点。首先能够直接测量冻干的蛋白质与保护剂蔗糖间的氢键[ 8 ] ,从而显示出蔗糖对蛋白质的保护作用;其次,Dean 等[ 6 ] 分别研究了蔗糖、葡聚糖、蔗糖与葡聚糖的混合物对冷冻干燥过程中蛋白质的保护作用,发现蔗糖对蛋白质具有保护作用,葡聚糖在冷冻和干燥过程中不能防止蛋白质变性,而蔗糖与葡聚糖的混合物则大大提高了在冷冻干燥过程中对蛋白质的保护作用。这说明在冷冻干燥过程中,保护剂的存在,可以避免蛋白质的变性,但并不是说加入保护剂就一定能保证蛋白质不变性,关键在于保护剂在蛋白质脱水后能否与氢键结合。尽管葡聚糖不能单独作为蛋白质的保护剂,但它具有高的解链温度(glass transition temperature) ,并能提高冻干蛋白质的储藏质量,因此和蔗糖等其它保护剂混合使用可以防止蛋白质的损伤,提高产品的质量。不同浓度的保护剂对蛋白质的保护作用不同,蔗糖浓度在1 %～5 %( W/ V ) 的范围内,随着蔗糖浓度的增加,蔗糖在冷冻干燥过程中保护蛋白质结构的能力增强;当蔗糖的浓度超过5 %( W/ V ) 时,随着蔗糖浓度的增加,其对蛋白质的保护作用减少[ 6 ] 。冷冻过程中的降温速率的选择与保护剂的浓度有关。如果保护剂的浓度很高,以不太高的降温速率就能使溶液以玻璃态固化。但由于过高的保护剂浓度对蛋白质分子产生毒性,一般选用的保护剂浓度较低,因此就要求有很高的降温速率[ 8 ] 。3 　关于玻璃化(vitrification) 的作用保持玻璃态的甘露醇在药品冷冻干燥过程中能够保护蛋白质的活性,而结晶的甘露醇则对蛋白质不能起保护作用[ 9 ] 。这说明只有保持玻璃态的保护剂在冷冻干燥过程中才能防止蛋白质的变性。Gerald 等[ 10 ] 研究了冷冻干燥抗杀白血病的酶2欧文菌L2天冬酰胺酶的过程中坍塌引起的酶蛋白的变性。含有单糖的低分子量的糖虽然在冷冻干燥过程中对蛋白质有保护作用,但由于其具有低的解链温度和坍塌温度(collapse tem2 perature) ,随着干燥过程的进行,当温度高于坍塌温度,就会形成坍塌的、表面结构破坏的药品,并且药品中的蛋白质失去活性,稳定性差,水蒸气含量高,可溶解性降低。由于双糖比单糖具有高的坍塌温度,因此把单糖和双糖混合配制成保护剂,或在低于坍塌温度下进行干燥,可以避免因坍塌而使药品失去活性。当冷冻干燥后的药品中的水含量增加时,固体状态的药品的坍塌温度显著地降低,因此冻干后的药品需要密闭防潮保存。4 　剩余水分(residual moisture) 对冻干蛋白质药品在储存过程中的质量影响　　关于剩余水分对冻干蛋白质药品在储存过程中的稳定性的影响,总的观点认为,冻干品越干燥,即含水量越低,则越容易长期稳定地保存,如美国制药工业规定,冷冻干燥药品的最终含水量应不超过1 %[ 11 ] 。有的研究者应用水的活度研究剩余水分对冻干蛋白质药品质量的影响,认为在水分较高时,蛋白质发生氧化变质的机率较大。但是上述观点近年来受到冲击,Hsu[ 11 ] 研究了组织型纤维蛋白溶酶原的剩余水分对冻干品质量的影响,发现冻干品在温度为50 ℃ 时储存50 d , 含水量为7. 6 % 的冻干品大部分失去活性,而含水量为4. 6 % 的冻干品活性变化很小。而生长激素冻干品在50 时储存50 d 后发现,含水量为4. 6 % 的冻干品失去活性,而含水量为7. 6 % 的冻干品活性基本不变。从而说明冻干品的水分并不是越低越好。因为每种蛋白质药品都含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定,过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。5 　存在的问题及解决方法目前,有关蛋白质冷冻干燥的研究重点是保护剂的选择及浓度对冻干后蛋白质质量的影响。蛋白质的冻干技术还不够成熟;冷冻干燥过程中压力的改变能否引起蛋白质变性还不清楚;对玻璃化、去玻璃化和结晶规律的了解甚微;冷冻过程中降温速率对蛋白质活性的影响还未见报道。关于冻干蛋白质复水后,蛋白质的活性、渗透压及功能的变化研究很少。蛋白质的冷冻干燥过程是复杂的传热、传质过程,其直接影响冻干品质量和干燥持续时间。冷冻过程中的降温速率决定溶液结晶及玻璃化程度,研究保护剂和蛋白质溶液的最佳降温速率,对于避免冷冻过程中蛋白质的变性具有重要意义。在冷冻干燥过程中,加热温度高、升温速率快将使干燥时间缩短,但同时过高的加热温度和过快的升温速率将导致蛋白质失去活性。以玻璃态存在的保护剂呈现出复杂的特性,当低于解链温度时,玻璃态物质具有粘度大和易脆的特点。当温度超过解链温度,玻璃态物质变软,随着干燥的进行,不断变型以至形成坍塌而失去活性。为了防止药品的坍塌,在一次干燥过程中,升华界面的温度必须低于解链温度, 但这样将导致加热时间延长。关于既保证加热温度不高于解链温度,又缩短干燥时间的冷冻干燥过程还未见报道冷冻干燥蛋白质的研究进展在加快,但国内并未跟上如此快速的研究步伐,应在国外研究成果的基础上,建立一次干燥和二次干燥的传热、传质数学模型,研究非稳定相变传热、传质特性,及其对蛋白质结构、功能、活性和干燥时间的影响;着重研究在冷冻过程中,降温速率对蛋白质活性的影响,以及溶液的结晶、玻璃化与去玻璃化的转变对蛋白质的变性机理。有文献报道了冷冻过程中降温速率对食品及生物材料营养成分及活性的影响,以及有关玻璃化保存方面的问题[ 8～12 ] 。应研究在干燥过程中加热温度对蛋白质失水率和活性的影响,研究如何控制在一次升华干燥过程中,加热温度低于解链温度,并减少加热时间;研究真空室压力的变化是否会引起蛋白质变性;研究不同的保护剂,对蛋白质的保护作用;研究冻干蛋白质的复水率,以及复水后蛋白质的渗透压、结构和功能的变化;优化冷冻干燥程序,减少蛋白质的变性,提高冻干品的质量。