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请问在在western blot过程中的高温变性是必须的吗?什么情况需要变性?什么情况不需要变性?如何避免磷酸化蛋白的降解?

相关实验:蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)

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dxy_v9xg5kw4

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3 个回答

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府宅

有帮助

不一定。

要低温操作:室温条件下,磷酸化蛋白很容易被蛋白磷酸酶降解。请勿反复冻融,操作时一定置于冰上。

加入抑制剂:组织或细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶,它会导致磷酸化蛋白的去磷酸化,因此,必须在裂解液中加入蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂。

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dxy_gwrp7ndq

有帮助

不一定要变性。
取决于选择的抗体识别的表位是什么样的。有些抗体会标明验证过哪些实验,例如WB,ELISA等,如果标有ELISA,IHC之类的,说明抗体可以识别天然状态下的蛋白,不用变性也可以检测。
但是如果抗体只标注做过WB就需要当心,因为很可能这个抗体只能检测到变性以后的线性表位,如果蛋白没有变性,有高级结构,就有可能检测不到。

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txs900416

有帮助

不一定需要变性,取决于抗体的识别的表位。若抗体识别的是一级结构,则蛋白需要变性,若抗体识别的是二级结构甚至三级,则不需要变性。此时要注意使用非变性胶。避免磷酸化蛋白的降解需要全程在低温操作,且加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂

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