我做NF-kB的EMSA实验方法和结果，条带不好，请大家指点！
丁香园
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核蛋白提取：
（1）5 millions个离心收集
（2）弃上清，细胞沉淀重悬于1.5ml冰预冷的PBS缓冲液，4℃下2000 rpm离心5min。
（3）弃上清，沉淀重悬于500μl冰预冷的Buffer A离心收集，再悬于0.5 ml Buffer A。
（4）冰上放置10分钟，加入NP40使终浓度为0.5%，混匀后，轻摇20秒。
（5）4℃下1330×g离心15分钟得到细胞核。
（6）重悬于50µl Buffer B，于冰上强烈振荡15分钟，4℃下16300×g离心10分钟。
（7）吸取上清，为核蛋白提取物。
（8）马上进行EMSA实验。
探针制备：
用γ-32P-ATP及T4多核苷酸激酶对合成的转录因子结合和突变型寡核苷酸的两条互补链分别进行末端标记。20 µl反应总体积中，加寡核苷酸10 pmol，10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液2µl，γ-32P-ATP 3 pmol，T4多核苷酸激酶10 u，37 ℃反应45 min，再置于68 ℃ 10 min灭活。在离心管中加入退火反应液60 µl，互补配对的两条链的标记产物各20 µl，于95 ℃变性5min，缓慢降温，使末端标记的互补单链寡核苷酸退火形成双链，保存于-20 ℃。
凝胶阻滞试验：
在结合缓冲液中加8 µl核蛋白，1µg poly (dI-dC)和100 fmol标记探针，反应总体积20 µl；在特异性竞争试验管中，则预先加入10 pmol冷探针（未标记的双链寡核苷酸），在非特异性竞争试管中预先加入10 pmol突变型双链寡核苷酸，混匀并室温放置30 min后再加入100 fmol标记探针。各反应管在室温中放置30min后，取反应液20µl上样，经5%非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离（150V，100min）后进行放射自显影（曝光16hr）。
部分缓冲液：
缓冲液A：HEAPES-NaOH (pH 7.8) 10 mmol/L，KCl 15 mmol/L，EDTA 0.1mmol/L，DTT 1 mmol/L，PMSF 1 mmol/L ，贮存于－20℃。
缓冲液B：HEAPES-NaOH (pH 7.9) 20 mmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，DTT 0.5 mmol/L，NaCl 0.42mol/L，EDTA 0.2mmol/L，甘油25%，PMSF 0.5mmol/L，贮存于－20℃。
结合缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl, NaCl 50 mmol/L, DTT 1.0 mmol/L , EDTA 1.0 mmol/L, 甘油5%，贮存于－20℃。
谢谢大家！
（1）5 millions个离心收集
（2）弃上清，细胞沉淀重悬于1.5ml冰预冷的PBS缓冲液，4℃下2000 rpm离心5min。
（3）弃上清，沉淀重悬于500μl冰预冷的Buffer A离心收集，再悬于0.5 ml Buffer A。
（4）冰上放置10分钟，加入NP40使终浓度为0.5%，混匀后，轻摇20秒。
（5）4℃下1330×g离心15分钟得到细胞核。
（6）重悬于50µl Buffer B，于冰上强烈振荡15分钟，4℃下16300×g离心10分钟。
（7）吸取上清，为核蛋白提取物。
（8）马上进行EMSA实验。
探针制备：
用γ-32P-ATP及T4多核苷酸激酶对合成的转录因子结合和突变型寡核苷酸的两条互补链分别进行末端标记。20 µl反应总体积中，加寡核苷酸10 pmol，10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液2µl，γ-32P-ATP 3 pmol，T4多核苷酸激酶10 u，37 ℃反应45 min，再置于68 ℃ 10 min灭活。在离心管中加入退火反应液60 µl，互补配对的两条链的标记产物各20 µl，于95 ℃变性5min，缓慢降温，使末端标记的互补单链寡核苷酸退火形成双链，保存于-20 ℃。
凝胶阻滞试验：
在结合缓冲液中加8 µl核蛋白，1µg poly (dI-dC)和100 fmol标记探针，反应总体积20 µl；在特异性竞争试验管中，则预先加入10 pmol冷探针（未标记的双链寡核苷酸），在非特异性竞争试管中预先加入10 pmol突变型双链寡核苷酸，混匀并室温放置30 min后再加入100 fmol标记探针。各反应管在室温中放置30min后，取反应液20µl上样，经5%非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳分离（150V，100min）后进行放射自显影（曝光16hr）。
部分缓冲液：
缓冲液A：HEAPES-NaOH (pH 7.8) 10 mmol/L，KCl 15 mmol/L，EDTA 0.1mmol/L，DTT 1 mmol/L，PMSF 1 mmol/L ，贮存于－20℃。
缓冲液B：HEAPES-NaOH (pH 7.9) 20 mmol/L，MgCl2 1.5mmol/L，DTT 0.5 mmol/L，NaCl 0.42mol/L，EDTA 0.2mmol/L，甘油25%，PMSF 0.5mmol/L，贮存于－20℃。
结合缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl, NaCl 50 mmol/L, DTT 1.0 mmol/L , EDTA 1.0 mmol/L, 甘油5%，贮存于－20℃。
谢谢大家！
