【共享】小论如何避免RNA提取时28s上方会多一条带

小弟我这段时间因为实验需要,开始大量的提取脑组织的RNA.以前提取RNA都是做逆转录吊基因用,所以对于RNA的要求不算是特别严格.但是这次的实验要求RNA提取纯度和精度都比较高,所以对于RNA提取的结果也就比较关注.
在前一段时间我提取RNA中一个比较明显的问题是在28s的上面会多出一条带,当时在本版上面问了很多战友,也看了相关的贴,发现这是一个比较普遍的问题,对于这条带的解释有些战友说是基因组残余,有些战友说是蛋白残余.解决方法上,有些战友提出要增加Trizol的用量,有些战友建议酚氯仿多次抽提.由于我手头的样品量相对充裕,所以小弟作了一些对照实验,以摸索比较优化的条件.现在将结果向各位战友汇报一下,希望能够对大家的实验有所帮助,

同时也以此向本版的”上海孤儿”大哥致敬,谢谢他以前为大家提供的无私帮助.

实验条件如下:
组织样品: 灵长类脑组织
提取试剂: Trizol
实验环境:  提取RNA专用超净台,进口无RNA酶枪头,其它实验用品如试管架等用实验前用75%酒精擦拭.
试验设计：每一管中都用100mg组织
lane1 1ml trizol 2，lane2 1.2ml Trizol，
lane3 1.5ml Trizol，lane4 2mlTrizol
以上用0.2倍体积氯仿，只用Trizol抽提一次
lane5 1ml Trizol，0.35体积氯仿，抽提一次
lane6 1ml Trizol, 0.35体积氯仿，抽提两次
lane7 1ml Trizol, 0.20体积氯仿，抽提两次
lane8 2ml Trizol，等体积氯仿

其中lane5为常规提取方法。
如果1-5有杂带，，67没有，说明是脑组织本身蛋白量和hnRNA过多，在提取时需要多次抽提。
如果1-5，7 没有杂带，68有说明是氯仿过多引入杂带（有段时间为了怕酚残留，我的氯仿加入量为0.35体积）
另外从1-4中可以看出是不是由于Trizol不足量导致的杂带残余。

试验结果分析：
1 随着TRIzol的增加，RNA提取出来的质量会更好一些，但是都无法消除最上面的杂带，说明是蛋白残余的可能性比较小。
2 从7号管和常规提取法的5管，以及虽然同样抽提两次，但是加入氯仿过量的6管来看，抽提两次可以有效去除杂带
3 从5，6，8号管来看，氯仿过量会带入杂质对于RNA最后质量弊大于利。
结论：
1 杂带是hnRNA残余（另有《RNA研究方法》（Robert E。Farrell。Jr）中相关章节描述支持）
2 用Trizol或者酚氯仿抽提两次可以有效去除多出的带