【原创】“分子克隆”中的一个错误的实验证明及延伸实验
丁香园
1083
“分子克隆”第三版有下面两段话： <font>DNA 和 RNA 纯制品的 OD260:OD280 值分别是 1.8 和 2.0，若样品中蛋白或酚的污染较严重，则 OD260:OD280 低于上述两个数值</font> (p1695 倒数第 5 行)。<font>水饱和酚在 270nm 处有特征性吸收，其 OD260:OD280 比值为 2 </font> (p1697 的框内倒数第 2 行)。
当时看到时就觉得这两段话是矛盾的；翻看英文版，发现没有翻译上的错误。难道真的会出现这样的现象：在 OD260:OD280 比值为 1.8 的纯 DNA 中加入比值为 2 的水饱和酚，则比值会小于 1.8？试图找原文 (Stulnig and Amberger 1994)，没有找到，所以自己用水饱和苯酚测。
以水做对照，测定含少量水饱和苯酚的 OD 值，结果如下：A230 = 0.024, A260 = 0.045, A270 = 0.070, A280 = 0.035；A270:A280 = 2，A260:A280 = 1.29，A270:A260 = 1.56，A260:A230 = 1.88。该实验证明：<font>水饱和酚在 270nm 处有特征性吸收，其 OD270:OD280 比值为 2，OD260:OD280 比值小于 1.8</font>。这样的结果与第一段话才完全吻合。
实验中还发现了如下几个现象：
1：我的仪器波长发生了偏移 – 标示 230nm，实际为 232nm；标示 260nm，实际为 262nm。实际的比标示的大 2nm。
2：在 230-280nm 范围，少量乙醇没有吸收；2mM 硫氰酸胍在 230nm 有非常强烈的吸收(已经超过了我的机器可以显示的范围)，而在 260nm 和 280nm 无吸收。
下面是我测定的一个 RNA 样品，事先知道可能会有蛋白质污染，但决不会再有其它杂质污染。用水 (pH <6.0) 稀释，并用同样的水做对照。
波长 228 230 232 258 260 262 278 280 282
OD 0.065 0.065 0.065 0.133 0.131 0.128 0.079 0.073 0.064
第一组：A258:A228 = 2.05, A258:A278 = 1.68
第二组：A260:A230 = 2.02, A260:A280 = 1.79
第三组：A262:A232 = 2.00, A262:A282 = 2.00
前面已经提到，我的仪器有 2nm 的波长误差，所以，第一组才是真正的 A260:A230 和 A260:A280 比值。本实验数据说明如下几点：
1：A230 和 A260 读数受波长误差影响很小，而 A280 受波长误差影响很大。所以 A260:A230 比值相对是稳定的，而 A260:A280 却会发生比较大的变化。
2：如果这次的实验样品非常纯 (A260:A280 = 2.00)，则 A264:A284 会大于 2.30 的。经常有战友提到其样品的比值大于 2.2，是否检测过你的仪器，其读数 260nm 实际上是大于 260nm 呢？如果你是在抽提完成后立即检测的，比值大于 2.0 决不会由降解导致，因为小寡核苷酸及单核苷酸在沉淀时被去除了。
总结如下：
1：“分子克隆”中提到的水饱和酚 OD260:OD280 = 2 是错误的，实际应该是 OD270:OD280 = 2。
2：水饱和酚 (包括酸性酚) 将导致 A260:A280 比值下降。
3：波长的少量漂移对 A260 几乎没有什么影响，但对 A280 有很大的影响，进而对 A260:A280 比值产生很大的影响。如果发现 A260:A280 大于 2.2，换一台仪器测一测；或者再沉淀一次样品，彻底洗涤后，再次测定。如果比值仍然大于 2.1，可以怀疑是该仪器的波长发生了漂移。
当时看到时就觉得这两段话是矛盾的；翻看英文版，发现没有翻译上的错误。难道真的会出现这样的现象：在 OD260:OD280 比值为 1.8 的纯 DNA 中加入比值为 2 的水饱和酚，则比值会小于 1.8？试图找原文 (Stulnig and Amberger 1994)，没有找到，所以自己用水饱和苯酚测。
以水做对照，测定含少量水饱和苯酚的 OD 值，结果如下：A230 = 0.024, A260 = 0.045, A270 = 0.070, A280 = 0.035；A270:A280 = 2，A260:A280 = 1.29，A270:A260 = 1.56，A260:A230 = 1.88。该实验证明：<font>水饱和酚在 270nm 处有特征性吸收，其 OD270:OD280 比值为 2，OD260:OD280 比值小于 1.8</font>。这样的结果与第一段话才完全吻合。
实验中还发现了如下几个现象：
1：我的仪器波长发生了偏移 – 标示 230nm，实际为 232nm；标示 260nm，实际为 262nm。实际的比标示的大 2nm。
2：在 230-280nm 范围，少量乙醇没有吸收；2mM 硫氰酸胍在 230nm 有非常强烈的吸收(已经超过了我的机器可以显示的范围)，而在 260nm 和 280nm 无吸收。
下面是我测定的一个 RNA 样品，事先知道可能会有蛋白质污染，但决不会再有其它杂质污染。用水 (pH <6.0) 稀释，并用同样的水做对照。
波长 228 230 232 258 260 262 278 280 282
OD 0.065 0.065 0.065 0.133 0.131 0.128 0.079 0.073 0.064
第一组：A258:A228 = 2.05, A258:A278 = 1.68
第二组：A260:A230 = 2.02, A260:A280 = 1.79
第三组：A262:A232 = 2.00, A262:A282 = 2.00
前面已经提到，我的仪器有 2nm 的波长误差，所以，第一组才是真正的 A260:A230 和 A260:A280 比值。本实验数据说明如下几点：
1：A230 和 A260 读数受波长误差影响很小，而 A280 受波长误差影响很大。所以 A260:A230 比值相对是稳定的，而 A260:A280 却会发生比较大的变化。
2：如果这次的实验样品非常纯 (A260:A280 = 2.00)，则 A264:A284 会大于 2.30 的。经常有战友提到其样品的比值大于 2.2，是否检测过你的仪器，其读数 260nm 实际上是大于 260nm 呢？如果你是在抽提完成后立即检测的，比值大于 2.0 决不会由降解导致，因为小寡核苷酸及单核苷酸在沉淀时被去除了。
总结如下：
1：“分子克隆”中提到的水饱和酚 OD260:OD280 = 2 是错误的，实际应该是 OD270:OD280 = 2。
2：水饱和酚 (包括酸性酚) 将导致 A260:A280 比值下降。
3：波长的少量漂移对 A260 几乎没有什么影响，但对 A280 有很大的影响，进而对 A260:A280 比值产生很大的影响。如果发现 A260:A280 大于 2.2，换一台仪器测一测；或者再沉淀一次样品，彻底洗涤后，再次测定。如果比值仍然大于 2.1，可以怀疑是该仪器的波长发生了漂移。
