引物延伸分析实验
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引物延伸分析用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端， 确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2 pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。
（1）引物延伸分析所用试剂：引物延伸实验需要模板RNA，可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物，用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物，还需要反转录酶，AMV或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺 凝胶试剂，和电泳装置。所得结果用放射自显影和磷成像仪分析。
（2）引物延伸系统的组分：引物延伸系统中AMV反转录酶和反应溶液、焦磷酸钠、正对照RNA模版和对照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物、T4多核苷酸 激酶和溶液、样品溶液、AMV反转录酶2X溶液100 mM Tris-HCl（pH8.3, 42℃）、100 mM KCl、 20 mM MgCl2、20 mM DTT、2 mM每一种dNTP、1 mM精胺。PhiX174标准分子参照物和T4 多核苷酸激酶用作引物标记，和确定延伸产物长度的标准。对照RNA可得到87个碱基的延伸产物作为正对照。引物延伸反应中用焦磷酸钠和精胺可增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。虽然其作用方式未确定，但结果是增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。MMLV被焦磷酸钠和精胺抑制，如使用MMLV，放线菌素D可用于增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。焦磷酸钠和放线菌素D抑制cDNA第二条链的合成。
（3）引物延伸实验的优化：
①杂交温度。
引物延伸实验中所用的杂交温度是最关键的需优化的因素。一般而言，最高紧密度，或引物和互补序列完全杂交所需的最适条件是，低于引物溶解温度的5oC。低于最高紧密度的温度可极大地增加杂交速度。应在不同的紧密度的杂交温度下作杂交，以控制引物和特异RNA的杂交。增加杂交紧密度时，带来的延伸产物的丢失表明，引物和相关的却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下，RNA在较高温度会降解，应用甲酰胺杂交操作方案，这可有效降低溶解温度，因此可使杂交在较低的温度进行。可在杂交步骤中用以下的溶液：40mMPIPES、1mMEDTA 、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺。如用这个杂交溶液，延伸步骤前甲酰胺和盐需用乙醇沉淀后除去。
②模板RNA和引物的量。
以下讨论了所用RNA模板和引物的起始量。反转录 酶对不同模板使用的效率不同。这部分是由于RNA中存在的次级结构干扰反转录酶的聚合酶活力。如产生短的产物，这通常不是一个问题。如用AMV反转录酶，延伸温度可达55℃。
③每次反应所用RNA的量。
每次反应所用RNA和引物的量取决于分析的RNA的种类（总RNA或poly(A) + RNA），目的RNA的相对丰度。如用总RNA，起始量为10ug，但分析稀有信号，每次反应用100 ugRNA。poly(A)+RNA每次反应用0.1-1.0 ug，具体决定于总RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特异RNA的浓度。在引物延伸分析前需检查目的RNA的完整。通过凝胶分析总RNA，应有完整的18S和28S核糖体RNA带。在引物延伸反应中用Northern印迹和RT-PCR分析来确定特定RNA的存在。
