【共享】PET重组质粒转化表达质粒中遇到的问题
丁香园
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晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的，但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌中表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction system（pET系列质粒）的发明者。
T7系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA polymerase识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株，染色体里面已经整合入了由LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase基因片断。如果在细菌培养基里面加入IPTG，来诱导T7 RNA polymerase的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强大，原因在于T7 RNA polymerase工作起来非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表达一个蛋白，表达量可以占到大肠杆菌总蛋白量的50%！大家可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对大肠杆菌有毒性，造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。
这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白，而且估计这个蛋白会形成包涵体。妖怪的是，用质粒转化蛋白表达菌株BL21（DE3）怎么也不能转化，铺的板一个菌落也没有。我当时就怀疑是因为表达的蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了五六次，最后终于找到了唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想过本底是怎么来的。
这个问题到了Bill Studier做报告之后，才真相大白。原来我们一般用的LB broth有三种成分，其中一种是tryptone。Tryptone是caseine的酶解产物，而casein又是milk里提取而来。由于milk有乳糖（lactose），tryptone里面也有乳糖的污染。Bill Studier研究发现即使很微量的lactose也能有效的诱导蛋白表达。原来如此！！！
所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。有意思的是，细菌有一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的glucose，细菌会优先摄取glucose，而不能摄取lactose。Bill Studier根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例的glucose和lactose。细菌首先摄取glucose，不摄取lactose，当细菌长到一定密度，耗完glucose之后，就开始摄取lactose，从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二天收细菌，提蛋白就行了。
最后Bill Studier老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈，如果有足够氧气在培养基里面，大肠杆菌的密度可以从一般的OD600 2-3翻十倍到20-30！要提高培养瓶的供氧，可以用baffled flask。这种flask的瓶底边缘有几处凹陷（类似于可乐塑料瓶底那样的形状），能有效增加空气培养基的混合。
T7系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA polymerase识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株，染色体里面已经整合入了由LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase基因片断。如果在细菌培养基里面加入IPTG，来诱导T7 RNA polymerase的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强大，原因在于T7 RNA polymerase工作起来非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表达一个蛋白，表达量可以占到大肠杆菌总蛋白量的50%！大家可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对大肠杆菌有毒性，造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。
这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白，而且估计这个蛋白会形成包涵体。妖怪的是，用质粒转化蛋白表达菌株BL21（DE3）怎么也不能转化，铺的板一个菌落也没有。我当时就怀疑是因为表达的蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了五六次，最后终于找到了唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想过本底是怎么来的。
这个问题到了Bill Studier做报告之后，才真相大白。原来我们一般用的LB broth有三种成分，其中一种是tryptone。Tryptone是caseine的酶解产物，而casein又是milk里提取而来。由于milk有乳糖（lactose），tryptone里面也有乳糖的污染。Bill Studier研究发现即使很微量的lactose也能有效的诱导蛋白表达。原来如此！！！
所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。有意思的是，细菌有一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的glucose，细菌会优先摄取glucose，而不能摄取lactose。Bill Studier根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例的glucose和lactose。细菌首先摄取glucose，不摄取lactose，当细菌长到一定密度，耗完glucose之后，就开始摄取lactose，从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二天收细菌，提蛋白就行了。
最后Bill Studier老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈，如果有足够氧气在培养基里面，大肠杆菌的密度可以从一般的OD600 2-3翻十倍到20-30！要提高培养瓶的供氧，可以用baffled flask。这种flask的瓶底边缘有几处凹陷（类似于可乐塑料瓶底那样的形状），能有效增加空气培养基的混合。
