【交流】NATURE文章，讨论农杆菌植物转化过程中的植物基因组中的相关基因的产物在转化过程中的作用
丁香园论坛
1989
寄主蛋白指导农杆菌介导植物转化
农杆菌在植物转化中已被广泛应用。因为起自然的转移外源DNA到寄主基因组的能力。它同时也是一个重要的植物病原物，这个病原体在几个农杆菌重要的物种中导致crown gall disease ，包括葡萄树、石榴、坚果树。在侵染寄主植物后，细菌从他肿瘤诱导的质粒中转移几种VIR蛋白和T-DNA到寄主细胞。在VIR蛋白的协助下，TDNA转移到寄主细胞的核中并且整合进寄主基因组中，当致癌基因在TDNA内存在，指导crown gall tumors的非控增殖，从而诱发crown gall disease。作为一个遗传工具，致癌基因被剔除了，这样遗传转化能有效的完成，而且不会发病。尽管农杆菌作为一个遗传工具的重要性和广泛的应用，但是农杆菌的TDNA转移到植物细胞和整合到植物基因组的机制仍然是不清楚。提高对这个过程的认识将有助于铺平提高转化技术的道路。
目前我们开始涉及TDNA核引进和基因组整合的重要元件有一个合理的了解。TDNA结合VIRD2蛋白进入植物细胞，VirD2是一种核酸内切酶，参与TDNA从Ti质粒上切下的过程，从而产生TDNA单链分子在5’与VirD2共价结合。几种其他的Vir蛋白也和TDNA一起被转移到植物细胞中，这些包括VirE2，他后来结合到而且沿着TDNA长度包裹住它。VirD2和VirE2包含核定位信号序列并且可能通过与Abidopsis的蛋白相互作用参与介导TDA复合体导入核内，包括VIP1和可能KAP-aVIP1结合VirE2，而且VIP1表达的反义抑制与核内VirE2targeting减少一致。AtKAP-a 属于名为importin蛋白家族，他以参与包含有NLS序列的蛋白核转位过程而著名。Ballas和Citovsky的研究表明AtKAP-a按照依赖于NLS方式体外与VirD2结合，但是这蛋白参与TDNA转移到核内体外证据缺乏。
在转移到核内后，结合的VirD2和包裹的VirE2和VIP1蛋白在TDNA整合到寄主基因组之前被除去了。Tzfira等研究表明细菌VirF，它伴随着TDNA复合物一起定位在植物细胞核内，是一种F-box蛋白，它与VIP1相互作用并且使VIP1和VirE2变得不稳定，可能是结合他们导致蛋白酶降解。VirF也与ArabidopsisSkp1同源物ASK1，因此可能与ASK1形成一种SCF（skp1-cullin-F-box）复合体。Tzfira发现VirF不与VirD2相互作用或者不使VirD2降解，这就表明VirD2可能直到后期仍然与TDNA结合。有证据表明VirD2在指导基因组整合的有效性和精确性上起附加作用。
相反，很少有人知道TDNA和Vir蛋白转移到植物细胞的调空和机制。细菌用第四类型的分泌体系来转移TDNA符合体和Vir蛋白穿过细菌被膜的双层膜。细菌的T4SS是有11个VirB基因和virD4编码的亚基的复合体。这个复合体有两个主要的结构成分：与膜有关的转移复合体，它跨两层膜的两侧；一个紧密相关的T型菌毛，它是一种细胞外丝状附着物。细菌的菌毛行使几种与介导细菌黏附在环境中具体的目标相关的的功能。T-pili在功能和结构上与F-pili相似，Fpilus在细胞结合时介导细胞与细胞之间黏附和DNA转移。Tpilus对于农杆菌毒性和TDNA转移是必要的。但是它在TDNA和vir蛋白穿过植物等离子膜中的具体的功能仍然不清楚。这期的plant cell中，Hwang和Gelin报道四个与主要T-pilus蛋白，VirB2，相互作用的Arabidopsis蛋白并且表明这些蛋白存在对于有效的转化是必要的。
作者用酵母双杂交方法鉴别了四种Arabidopsis蛋白，它们与VirB2相互作用：三个以前不知道功能相关蛋白命名为VirB2-interacting蛋白，BTI1-3，和Ras相关的小GTP酶，AtRAB8。在酵母中的进一步检测表明所有四个蛋白专一地与VirB2相互作用并不与其它农杆菌测试的Vir蛋白作用。发现BTI蛋白相互作用并且在离体情况下与AtRAB8相互作用，BTI蛋白超量表达进一步表明所有四种蛋白对有效的转化有促进作用。有趣的是，在农杆菌侵染后BTI蛋白水平马上短暂的增长。最后，绿色荧光蛋白定位：BTI融合蛋白用confocal显微镜观察，表明BTI蛋白优先分布在转基因植株的根细胞的外围。作者提出假说：三个BTI蛋白和AtRAB8与Tpilus在体外相互作用并且涉及启动农杆菌与植物细胞相互作用。
三个BTI和AtRAB8的蛋白序列分析支持这些蛋白可能在TDNA和Vir蛋白的在植物等离子膜间传递过程中起作用。BTI蛋白都有一个网状同源结构域，它包括两个大的疏水区，这两个区域被一个约66氨基酸环在C端隔开。RNTs弥补一个家族蛋白，这个蛋白在动物细胞质内网状膜上富含。Oertle在高度趋异真核生物中鉴定了多余250个象RNT基因，包括真菌，动和植物。这些作者提出假说：RTN蛋白早期出现在真核生物进化与内膜系统建立交叉的时候，在这个过程中它们被公认起着基础的作用。Rab GTP酶一在膜运输过程中起重要的调空作用，特别在与vesicle形成和visicle docking起始。Rab蛋白在GDP结合蛋白失活型和GTP结合激活型之间的转换过程中起作用。激活的GTP结合Rab蛋白与泡状体运输有关。在泡状体融合后，GTP水解产生非活性的GDP结合的Rab，它通过其它蛋白的作用又循环回到起始的膜那里。Hwang和Gelvin的工作给这个关于T-pilus和涉及T-DNA复合体穿过植物细胞膜的调空因子的功能方面的黑瞎子首先提供了些信息。Tpilus是否形成一个通道，通过这个通道TDNA和Vir蛋白转运到植物细胞中去或者是否Tpilus仅仅在与植物细胞表面首先接触时起作用并且在跨植物细胞膜复合体形成中起一些其他作用，这些现在仍然不清楚。四种定位在植物细胞外围和专一与VirB2相互作用的蛋白的鉴别将有助于进一步调查这个问题。
除此之外，涉及农杆菌介导的转化的调空的植物蛋白的知识可能导致植物转化工程体系统的提高和这种有用工具在反抗的物种的发展。Nam等用另一种方案启动了一个项目，这个项目坚定了大量的TDNAArabidopsis插入突变体，这些突变体拒绝农杆菌介导的转化（rat）。大于125个rat突变体被鉴定。它们破坏了转化过程中的许多步骤，从与细菌表面接触的起始到核转运和TDNA整合。这证明了成功的转化需要大量寄主蛋白的参与和辅助。
植物转化过程中，大家知道是植物受伤后产生的酚类物质或搪类诱导VirG/A的表达从而启动Vir区的表达，进而完成一系列的TDNA区的剪切，单连复合体的构件，T-pilus的形成，单连的转移，在植物细胞中向核内转移，整合等等，那么会不会有一种信号（？？？？）来促使植物表达特定的蛋白来参与单连的转移和整合呢？也就是说在感受态的植物细胞中存在这种机制，所以他的转化相对简单？这种信号可能来自受伤植物本身，也可能来自农杆菌的相互作用产生？？
期待着更多的相关研究结果，能充实农杆菌转化技术的理论，能更好的改进转化方法，造福于大肿！
农杆菌在植物转化中已被广泛应用。因为起自然的转移外源DNA到寄主基因组的能力。它同时也是一个重要的植物病原物，这个病原体在几个农杆菌重要的物种中导致crown gall disease ，包括葡萄树、石榴、坚果树。在侵染寄主植物后，细菌从他肿瘤诱导的质粒中转移几种VIR蛋白和T-DNA到寄主细胞。在VIR蛋白的协助下，TDNA转移到寄主细胞的核中并且整合进寄主基因组中，当致癌基因在TDNA内存在，指导crown gall tumors的非控增殖，从而诱发crown gall disease。作为一个遗传工具，致癌基因被剔除了，这样遗传转化能有效的完成，而且不会发病。尽管农杆菌作为一个遗传工具的重要性和广泛的应用，但是农杆菌的TDNA转移到植物细胞和整合到植物基因组的机制仍然是不清楚。提高对这个过程的认识将有助于铺平提高转化技术的道路。
目前我们开始涉及TDNA核引进和基因组整合的重要元件有一个合理的了解。TDNA结合VIRD2蛋白进入植物细胞，VirD2是一种核酸内切酶，参与TDNA从Ti质粒上切下的过程，从而产生TDNA单链分子在5’与VirD2共价结合。几种其他的Vir蛋白也和TDNA一起被转移到植物细胞中，这些包括VirE2，他后来结合到而且沿着TDNA长度包裹住它。VirD2和VirE2包含核定位信号序列并且可能通过与Abidopsis的蛋白相互作用参与介导TDA复合体导入核内，包括VIP1和可能KAP-aVIP1结合VirE2，而且VIP1表达的反义抑制与核内VirE2targeting减少一致。AtKAP-a 属于名为importin蛋白家族，他以参与包含有NLS序列的蛋白核转位过程而著名。Ballas和Citovsky的研究表明AtKAP-a按照依赖于NLS方式体外与VirD2结合，但是这蛋白参与TDNA转移到核内体外证据缺乏。
在转移到核内后，结合的VirD2和包裹的VirE2和VIP1蛋白在TDNA整合到寄主基因组之前被除去了。Tzfira等研究表明细菌VirF，它伴随着TDNA复合物一起定位在植物细胞核内，是一种F-box蛋白，它与VIP1相互作用并且使VIP1和VirE2变得不稳定，可能是结合他们导致蛋白酶降解。VirF也与ArabidopsisSkp1同源物ASK1，因此可能与ASK1形成一种SCF（skp1-cullin-F-box）复合体。Tzfira发现VirF不与VirD2相互作用或者不使VirD2降解，这就表明VirD2可能直到后期仍然与TDNA结合。有证据表明VirD2在指导基因组整合的有效性和精确性上起附加作用。
相反，很少有人知道TDNA和Vir蛋白转移到植物细胞的调空和机制。细菌用第四类型的分泌体系来转移TDNA符合体和Vir蛋白穿过细菌被膜的双层膜。细菌的T4SS是有11个VirB基因和virD4编码的亚基的复合体。这个复合体有两个主要的结构成分：与膜有关的转移复合体，它跨两层膜的两侧；一个紧密相关的T型菌毛，它是一种细胞外丝状附着物。细菌的菌毛行使几种与介导细菌黏附在环境中具体的目标相关的的功能。T-pili在功能和结构上与F-pili相似，Fpilus在细胞结合时介导细胞与细胞之间黏附和DNA转移。Tpilus对于农杆菌毒性和TDNA转移是必要的。但是它在TDNA和vir蛋白穿过植物等离子膜中的具体的功能仍然不清楚。这期的plant cell中，Hwang和Gelin报道四个与主要T-pilus蛋白，VirB2，相互作用的Arabidopsis蛋白并且表明这些蛋白存在对于有效的转化是必要的。
作者用酵母双杂交方法鉴别了四种Arabidopsis蛋白，它们与VirB2相互作用：三个以前不知道功能相关蛋白命名为VirB2-interacting蛋白，BTI1-3，和Ras相关的小GTP酶，AtRAB8。在酵母中的进一步检测表明所有四个蛋白专一地与VirB2相互作用并不与其它农杆菌测试的Vir蛋白作用。发现BTI蛋白相互作用并且在离体情况下与AtRAB8相互作用，BTI蛋白超量表达进一步表明所有四种蛋白对有效的转化有促进作用。有趣的是，在农杆菌侵染后BTI蛋白水平马上短暂的增长。最后，绿色荧光蛋白定位：BTI融合蛋白用confocal显微镜观察，表明BTI蛋白优先分布在转基因植株的根细胞的外围。作者提出假说：三个BTI蛋白和AtRAB8与Tpilus在体外相互作用并且涉及启动农杆菌与植物细胞相互作用。
三个BTI和AtRAB8的蛋白序列分析支持这些蛋白可能在TDNA和Vir蛋白的在植物等离子膜间传递过程中起作用。BTI蛋白都有一个网状同源结构域，它包括两个大的疏水区，这两个区域被一个约66氨基酸环在C端隔开。RNTs弥补一个家族蛋白，这个蛋白在动物细胞质内网状膜上富含。Oertle在高度趋异真核生物中鉴定了多余250个象RNT基因，包括真菌，动和植物。这些作者提出假说：RTN蛋白早期出现在真核生物进化与内膜系统建立交叉的时候，在这个过程中它们被公认起着基础的作用。Rab GTP酶一在膜运输过程中起重要的调空作用，特别在与vesicle形成和visicle docking起始。Rab蛋白在GDP结合蛋白失活型和GTP结合激活型之间的转换过程中起作用。激活的GTP结合Rab蛋白与泡状体运输有关。在泡状体融合后，GTP水解产生非活性的GDP结合的Rab，它通过其它蛋白的作用又循环回到起始的膜那里。Hwang和Gelvin的工作给这个关于T-pilus和涉及T-DNA复合体穿过植物细胞膜的调空因子的功能方面的黑瞎子首先提供了些信息。Tpilus是否形成一个通道，通过这个通道TDNA和Vir蛋白转运到植物细胞中去或者是否Tpilus仅仅在与植物细胞表面首先接触时起作用并且在跨植物细胞膜复合体形成中起一些其他作用，这些现在仍然不清楚。四种定位在植物细胞外围和专一与VirB2相互作用的蛋白的鉴别将有助于进一步调查这个问题。
除此之外，涉及农杆菌介导的转化的调空的植物蛋白的知识可能导致植物转化工程体系统的提高和这种有用工具在反抗的物种的发展。Nam等用另一种方案启动了一个项目，这个项目坚定了大量的TDNAArabidopsis插入突变体，这些突变体拒绝农杆菌介导的转化（rat）。大于125个rat突变体被鉴定。它们破坏了转化过程中的许多步骤，从与细菌表面接触的起始到核转运和TDNA整合。这证明了成功的转化需要大量寄主蛋白的参与和辅助。
植物转化过程中，大家知道是植物受伤后产生的酚类物质或搪类诱导VirG/A的表达从而启动Vir区的表达，进而完成一系列的TDNA区的剪切，单连复合体的构件，T-pilus的形成，单连的转移，在植物细胞中向核内转移，整合等等，那么会不会有一种信号（？？？？）来促使植物表达特定的蛋白来参与单连的转移和整合呢？也就是说在感受态的植物细胞中存在这种机制，所以他的转化相对简单？这种信号可能来自受伤植物本身，也可能来自农杆菌的相互作用产生？？
期待着更多的相关研究结果，能充实农杆菌转化技术的理论，能更好的改进转化方法，造福于大肿！
