【建议】Southern和Northern中的奇怪问题？请大家讨论。
丁香园论坛
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mylab大师你好：
小人有几个问题想求助，非常着急，希望你能出手。本人刚开始做southern和northern，出现了几个棘手的问题无法解决，希望你能帮助，感谢！
第一张图是Northern杂交，最右边的是Marker（出现了一些非特异结合，很正常）剩下的都是总RNA的杂交条带，孔的浓度是一个梯度，大体都在10ug左右，不知为什么这么淡，是不是有RNA降解的可能？或者是我的杂交液中的探针浓度不够（我用的浓度一定比说明书上的高）？显色时间比较长所以背景比较深。我用的试剂盒是Roche的DIG Northern Starter Kit，没有用他的显色底物，而是用的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I中的NBT/BCIP底物，因为我没有显影液和定影液，所以没有用CDP-Star。还有为什么在边缘的条带跑的快，是不是MOPS电泳缓冲液的原因，我在整个电泳过程中没有换过缓冲液，电泳大约2个小时左右，没40分钟停止电泳，拿出胶后搅一搅缓冲液。
第二张图是Southern杂交，用的是DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，样品1是质粒的酶切产物（阳性对照），其实不用酶切，多余了。用了100ng左右，好像有点多，酶切了4小时。下次试一下不酶切的可能就没有问题了。样品2是阴性对照，没有条带。紧接着4个样品是不同单酶切细胞基因组DNA，最后一个是Marker。问题1是为什么单酶切杂交后出现多条带，是因为多拷贝的关系吗？问题2是为什么会出现指纹状的背景，我全程带橡胶手套而且就是橡胶手套也没碰到膜，碰到膜的仅仅是镊子和自治杂交带的内侧。有的背景是气泡造成的可以看出，还有的就不知道了。听说杂交后洗膜的时候undefinedSSC和0.1％SDS中如果SDS没有溶解可能会出现这个问题吗？还有我没有用杂交袋，而是自制的杂交袋，就是自封袋但是自封袋内侧用酒精冲洗，并用Milli-Q的去离子水冲干净了。是不是这个原因导致的？可是我的Northen杂交就没有这个问题?可能我做Northen的操作要比Southern严格多了吧，几乎全程在超净工作台中做的，所有的液体都是用DEPC处理过的。
郁闷希望大师能帮助解决。
小人有几个问题想求助，非常着急，希望你能出手。本人刚开始做southern和northern，出现了几个棘手的问题无法解决，希望你能帮助，感谢！
第一张图是Northern杂交，最右边的是Marker（出现了一些非特异结合，很正常）剩下的都是总RNA的杂交条带，孔的浓度是一个梯度，大体都在10ug左右，不知为什么这么淡，是不是有RNA降解的可能？或者是我的杂交液中的探针浓度不够（我用的浓度一定比说明书上的高）？显色时间比较长所以背景比较深。我用的试剂盒是Roche的DIG Northern Starter Kit，没有用他的显色底物，而是用的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I中的NBT/BCIP底物，因为我没有显影液和定影液，所以没有用CDP-Star。还有为什么在边缘的条带跑的快，是不是MOPS电泳缓冲液的原因，我在整个电泳过程中没有换过缓冲液，电泳大约2个小时左右，没40分钟停止电泳，拿出胶后搅一搅缓冲液。
第二张图是Southern杂交，用的是DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，样品1是质粒的酶切产物（阳性对照），其实不用酶切，多余了。用了100ng左右，好像有点多，酶切了4小时。下次试一下不酶切的可能就没有问题了。样品2是阴性对照，没有条带。紧接着4个样品是不同单酶切细胞基因组DNA，最后一个是Marker。问题1是为什么单酶切杂交后出现多条带，是因为多拷贝的关系吗？问题2是为什么会出现指纹状的背景，我全程带橡胶手套而且就是橡胶手套也没碰到膜，碰到膜的仅仅是镊子和自治杂交带的内侧。有的背景是气泡造成的可以看出，还有的就不知道了。听说杂交后洗膜的时候undefinedSSC和0.1％SDS中如果SDS没有溶解可能会出现这个问题吗？还有我没有用杂交袋，而是自制的杂交袋，就是自封袋但是自封袋内侧用酒精冲洗，并用Milli-Q的去离子水冲干净了。是不是这个原因导致的？可是我的Northen杂交就没有这个问题?可能我做Northen的操作要比Southern严格多了吧，几乎全程在超净工作台中做的，所有的液体都是用DEPC处理过的。
郁闷希望大师能帮助解决。
