（原创）自己摘抄得超星（DNA和RNA试验）一书，支持一下
丁香园论坛
804
【xx】既然是摘抄的就共享吧，不要原创了。谢谢！
我发现比较好得超星书籍，但是无法复制和拷贝，只有自己写了，我摘抄了一些大家平时关注得问题，谢谢支持！
从组织培养细胞中同时分离DNA和RNA
1. PBS:0.137MOL/L NACL,2.68mmol/l KCL,7.98mmol/l NA2HPO4,1.47mmol/l KH2PO4,PH7.2
2. 二乙其焦炭酸盐（DEPC）处理水，1mlDEPC加入到1L得重蒸水中（0.1%DEPCv/v）后搅拌过夜。20psi(1psi=6.8undefined10(3)PA),高压灭菌20min可以使得DEPC失活
3. STEL缓冲液：0.2%SDS,10mmol/l tris-hcl,PH7.5,10mmol/l EDTA,100mmol/l LiCl,在DEPC处理过得水中加入TRIS-CL,EDTA和LIcl,高压灭菌后加入适量得10％得SDS，10gSDS溶于DEPC处理得水中配置成10％SDS贮存液，使用前65度保温2h.
4. 酚;酚得平衡如前所，先用PH8.0得0.5mol/l Tris-hcl抽提含有，1％8－羟基喹琳得超纯重蒸酚一次，然后用PH8.0得0.1mol/lTris HCL反复抽提取直到液相得PH值至8.0为止。使用前再次使用STEL抽提缓冲液平衡二次。经平衡处理得酚至少可以4度贮存2个月
5. 酚、氯仿混合物：将等体积得氯仿加入STEL平衡过得酚中混合，混合物至少能在4度保存2个月。处理酚得时候必须戴上手套并在通风柜中
6. 5mol/llicl:使用DEPC处理得水配置并进行高压灭菌
7. TE:10mmol/l Tris HCL,ph8.0,mmol/ln EDTA,PH8.0,用DEPC处理过得水配置进行高压灭菌
8. RNA保护试剂
2．2上述方法得变化，用于黏附型得细胞培养物和组织
1.姨蛋白酶：以0.125%得浓度溶于PBS，短时间可以保存于4度冰箱中，长时间则保存于冰冻柜中
3．方法
（1）细胞培养液（1×10（7））应至于冰水浴中。倒于15ml得聚丙烯管中，以100g离心5分钟，用10ml冰冷却的PBS缓冲液洗涤后再次离心，处理其他样品时候将沉淀至于冰水浴中
（2）同时向管中加入5mlSTEL平衡过的酚与5ml冰冷却的STEL缓冲液，轻轻倒转3－5min使沉淀细胞彻底悬浮
（3）20度中100000g离心5min使两相分离，用灭菌的聚丙烯移液管将水相移至一个薪的管中，再次使用等体积的酚氯仿抽提两次
（4）将水相移至一个50ml的FACOL管中，加入0.1杯的体积的5mol/l 的冰冷却的的LICL与2倍体积冰冷却的无水乙醇使高相对分子质量的DNA从RNA中分离出来，这是的DNA哕立刻移线团状沉淀出来
（5）轻轻使用代沟的玻璃帮缠绕DNA使其呈结构紧密状态，将玻璃梆靠在馆子的壁上以除去残留的乙醇，用1ml70％冰冷却的乙醇淋洗缠绕在玻璃帮上的DNA以除去其中的盐分，小心的用冰冷却的TE（PH8.0）淋洗DNA以除去残留的乙醇
（6）玻璃棒上的DNA融解与适当的体积的TE（PH8.0）上并与4度保存
（7）将剩余的溶液至于－70度冰箱中或是乙醇中冰浴30min使RNA沉淀出来
（8）10000g离心15min沉淀RNA沉淀出来并小心的抽气除去上层残余上清夜，用冰于冷的70％的乙醇淋洗沉淀，再次离心5min并除去上清夜，RNA沉淀真空干燥后使用DEPC处理过的水融解。
（9）加入5－10u的RNasin
3．2．2组织的核算抽提
（1）使用冰冷却的PBS缓冲液淋洗约500mg的无血组织，冷却后用灭菌刀片切呈3－5cm3的小块
（2）将块状组织逐渐的加入装有液氮的波体中研磨至粉
（3）缓慢的将粉碎的组织加入已混合有5ml酚和5mlSTEL溶液中，操作时最好经烘干的玻璃帮逐渐将粉碎的组织搅到酚/STEL的乳浊液中，直至组分混匀，继续轻轻上下离心管5min
注释：
（1） DEPC有毒可以作为催化剂作用与蛋白质的组氨酸以及硌氨酸，所以象TRISHCL溶液等敏感材料不能直接用于使其处理，可以使用DEPC处理过的水
（2） 使其收集到的细胞与组织处于低温状态下有利于保持核算的完整性
（3） 此方法成功的关键是是否能在温和的条件下破碎细胞的同时使DNA保持相对分子质量的完整型，用STEL/酚处理时应该缓慢将管中上下倒转，这样可以减少DNA分子的剪切力
（4） 首次酚抽提时分配与水相与酚相界面上的含蛋白质水溶液可以使用酚、氯仿再次抽屉提高DNA的回收效率
（5） 氯仿中通常以24：1（V/V）的比例加入异丙醇，后者是一种消炮剂，我们发现当用温和手法倒转或是在转轮上转动管子的时候不存在产生泡沫问题，所以可以省略异丙醇
（6） DNA可以空气干燥，但是再次融解时间比较长
（7） 所用细胞数1。5×10(7)-2undefined10(7)
(二)DNA酶切
（1） 每一中酶有自己的适合的缓冲液，分别是高盐，中盐，低盐，使用时在待消化样品中加入终体积的1/10就可以了。错缓冲液会导致酶活力下降，酶切特意行改变甚至与活力完全消失
（2） 缓冲液 NACL(mmol/l)
trisHCL（PH7.5)
MGCL2 DTT
（3） 高盐 （4） 100 （5） 50 （6） 10 1
（7） 中盐 （8） 50 （9） 10 （10） 10 1
（11） 低盐 （12） 无 （13） 10 （14） 10 1
(3)可以使用通用buffer，但是有些情况酶活力会下降到最大活力的20％，这种通用缓冲液是谷氨酸甲盐和醋酸甲盐缓冲液，特别适合与需要两种完全不同系统的DNA切割试验
（4）待切割DNA的量取决与以后的试验步骤，如果是为了鉴定质粒DNA中是否插入片断，那么合适的酶切DNA的量约为500ng-1ug，当然酶切的DNA的量与插入片断的大小有关，插入片断越小酶切DNA的量就应该越大，只有这样才能在以后的电泳中观察到
（5）所切割的DNA应该有较高的纯度，DNA样品中不能存在如酚，氯仿，乙醇，盐，去污剂，已经契合机等杂质，就是痕量也会抑制酶的反应或是失活
（6）稳定低蛋白浓度的酶制剂以及防止变形，酶的反应体系应该加入BSA
(7)酶切必须使用高质量的灭菌水，水中不含有无机离子，有机化合物
（8）1个酶单位的定义：在最适合的温度与缓冲液的条件下，1h内完全切割1ug的标准的DNA所需要的量
（9）切割基因组DNA时候加入的亚精氨至浓度为1mmol/l能显著提高酶切效率，因为带正电荷的杂质结合，需要注意低温条件下亚精氨可使DNA沉淀，所以反应物至于冰上不能加入亚精氨
（10）实际使用的酶切最小体积是10ul
(11)不少酶对甘油敏感，如果甘油浓度超过10％会发生非特异性位点切割（称为星号活力），为了避免这种情况发生应加酶量控制在反应体积的比例为1：10 ，或是更低
（12）酶对热不稳定，必须马上至于冰箱
（13）大多数酶是在37度保温进行，但不是所有的酶都是如此，例如TAQ1为65度，所以使用前应先核对一下说明书
（14）无论什么体积的酶混合液都要避免漩涡振荡器的使用，这种操作会影响酶的活性，只要轻轻用手弹管壁进行混合，然后放在离心机中离心1－5S使得液体都集中在管子底部就可以了
（三）琼脂糖凝胶电泳
（1） 缓冲液
LE 高离子强度，不适合制备型电泳
甘氨酸 低离子强度，非常适合与制备型电泳，也可以用于分析电泳
TRIS-硼酸－EDTA 低离子强度，可以用于制备型或是分析型电泳
TRIS－醋酸－TAE 特别适合用于分析型和用玻璃柱纯化DNA片断得制备型电泳
注释：
（1） EB加入胶中或是缓冲液中进行电泳，而乐于在电泳后将胶染色，这是因为EB加入到胶中后会影响DNA得迁移，特别是当分子中有环装构型（超螺旋或是开环）得质粒时候。不过当有或是无EB得条件一致时就不会有什么困难了。使用EB遇到得第二个问题就是EB会促使紫外灯照射下得DNA得损伤（光切口），所以胶中或是缓冲液中含有EB得电泳，最好减少观察时间以防止DNA得损伤以后再次电泳形成模糊得条代
（2） 进行分析电泳得产生得最佳分辨率得电场强度约为10V/cm，如果DNA片断为5KB或是更大则采用5V/cm才能得到最佳分辨率，当DNA片断小于1KB时采用较高得电场强度通常也能得到较好得分辨率。
（四）souther 杂交
1．方法
（1）材料
1．尼龙杂交膜，毛细血管转移系统，脱飘令缓冲液（0.25mol/l HCL）,变性缓冲液：1.5mol/l NAcl,0.5mol/l naoh,转移缓冲液：1.5mol/Lnacl ,0.25mol/l naoh,2undefinedSSC:3mol/l NACL,0.3mol/l柠檬酸钠
（2）步骤
1．酶切DNA进行电泳分离
2．用干净刀片切去无用胶
3．将凝胶浸泡在约3倍体积得脱飘令缓冲液中，与室温缓慢摇动30min或是待胶中得溴芬兰变为黄色为止
4．倾泻除去脱飘令缓冲液，加入3倍体积得变性缓冲液，室温下轻轻摇动30min
5,倾泻除去变性缓冲液，加入3倍体积得转移缓冲液，室温下轻轻摇动30min,以利于平衡
6．将胶放在灌有转移缓冲液得毛细管转移装置平台上，转移装置如图
1KG
纸巾
3MM滤纸，杂交膜（分两层）
胶
塑料家
转移缓冲液
7．剪下一块与胶大小相同得尼龙膜漂浮与重蒸水水面上使之湿润，然后用转移缓冲液淋洗，将膜覆盖与胶上并赶走气泡
8将4张3MM滤纸剪成与胶同样大小，其中两张浸泡与转移液后覆盖与膜上，赶走所有气泡，另外两张干得至于两张湿的滤纸上部，然后在上层滤纸上放一叠干得纸巾，在纸巾得顶部压1g得重物，转移至少2h
9. 卸下转移装置，在凝胶与膜分离之前先在电样孔得位置坐上记号，如果是用铅笔做记号得话，就会在以后得放射自显影底片上出现记号，用2×SSC缓冲液淋洗膜后放在80度烘箱中烘烤20－60分钟
10. 用312nm的紫外灯投射灯可以使得DNA共价交联 与膜上，将膜得含DNA一面向下放在一片保险膜上与紫外灯下照射2－3min
与标准得DNA片断对照可以定出杂交条代得所显示得分子大小，最好是使用经放射性同位素标记得相对分子质量标准，这样在最后得放射自显
我发现比较好得超星书籍，但是无法复制和拷贝，只有自己写了，我摘抄了一些大家平时关注得问题，谢谢支持！
从组织培养细胞中同时分离DNA和RNA
1. PBS:0.137MOL/L NACL,2.68mmol/l KCL,7.98mmol/l NA2HPO4,1.47mmol/l KH2PO4,PH7.2
2. 二乙其焦炭酸盐（DEPC）处理水，1mlDEPC加入到1L得重蒸水中（0.1%DEPCv/v）后搅拌过夜。20psi(1psi=6.8undefined10(3)PA),高压灭菌20min可以使得DEPC失活
3. STEL缓冲液：0.2%SDS,10mmol/l tris-hcl,PH7.5,10mmol/l EDTA,100mmol/l LiCl,在DEPC处理过得水中加入TRIS-CL,EDTA和LIcl,高压灭菌后加入适量得10％得SDS，10gSDS溶于DEPC处理得水中配置成10％SDS贮存液，使用前65度保温2h.
4. 酚;酚得平衡如前所，先用PH8.0得0.5mol/l Tris-hcl抽提含有，1％8－羟基喹琳得超纯重蒸酚一次，然后用PH8.0得0.1mol/lTris HCL反复抽提取直到液相得PH值至8.0为止。使用前再次使用STEL抽提缓冲液平衡二次。经平衡处理得酚至少可以4度贮存2个月
5. 酚、氯仿混合物：将等体积得氯仿加入STEL平衡过得酚中混合，混合物至少能在4度保存2个月。处理酚得时候必须戴上手套并在通风柜中
6. 5mol/llicl:使用DEPC处理得水配置并进行高压灭菌
7. TE:10mmol/l Tris HCL,ph8.0,mmol/ln EDTA,PH8.0,用DEPC处理过得水配置进行高压灭菌
8. RNA保护试剂
2．2上述方法得变化，用于黏附型得细胞培养物和组织
1.姨蛋白酶：以0.125%得浓度溶于PBS，短时间可以保存于4度冰箱中，长时间则保存于冰冻柜中
3．方法
（1）细胞培养液（1×10（7））应至于冰水浴中。倒于15ml得聚丙烯管中，以100g离心5分钟，用10ml冰冷却的PBS缓冲液洗涤后再次离心，处理其他样品时候将沉淀至于冰水浴中
（2）同时向管中加入5mlSTEL平衡过的酚与5ml冰冷却的STEL缓冲液，轻轻倒转3－5min使沉淀细胞彻底悬浮
（3）20度中100000g离心5min使两相分离，用灭菌的聚丙烯移液管将水相移至一个薪的管中，再次使用等体积的酚氯仿抽提两次
（4）将水相移至一个50ml的FACOL管中，加入0.1杯的体积的5mol/l 的冰冷却的的LICL与2倍体积冰冷却的无水乙醇使高相对分子质量的DNA从RNA中分离出来，这是的DNA哕立刻移线团状沉淀出来
（5）轻轻使用代沟的玻璃帮缠绕DNA使其呈结构紧密状态，将玻璃梆靠在馆子的壁上以除去残留的乙醇，用1ml70％冰冷却的乙醇淋洗缠绕在玻璃帮上的DNA以除去其中的盐分，小心的用冰冷却的TE（PH8.0）淋洗DNA以除去残留的乙醇
（6）玻璃棒上的DNA融解与适当的体积的TE（PH8.0）上并与4度保存
（7）将剩余的溶液至于－70度冰箱中或是乙醇中冰浴30min使RNA沉淀出来
（8）10000g离心15min沉淀RNA沉淀出来并小心的抽气除去上层残余上清夜，用冰于冷的70％的乙醇淋洗沉淀，再次离心5min并除去上清夜，RNA沉淀真空干燥后使用DEPC处理过的水融解。
（9）加入5－10u的RNasin
3．2．2组织的核算抽提
（1）使用冰冷却的PBS缓冲液淋洗约500mg的无血组织，冷却后用灭菌刀片切呈3－5cm3的小块
（2）将块状组织逐渐的加入装有液氮的波体中研磨至粉
（3）缓慢的将粉碎的组织加入已混合有5ml酚和5mlSTEL溶液中，操作时最好经烘干的玻璃帮逐渐将粉碎的组织搅到酚/STEL的乳浊液中，直至组分混匀，继续轻轻上下离心管5min
注释：
（1） DEPC有毒可以作为催化剂作用与蛋白质的组氨酸以及硌氨酸，所以象TRISHCL溶液等敏感材料不能直接用于使其处理，可以使用DEPC处理过的水
（2） 使其收集到的细胞与组织处于低温状态下有利于保持核算的完整性
（3） 此方法成功的关键是是否能在温和的条件下破碎细胞的同时使DNA保持相对分子质量的完整型，用STEL/酚处理时应该缓慢将管中上下倒转，这样可以减少DNA分子的剪切力
（4） 首次酚抽提时分配与水相与酚相界面上的含蛋白质水溶液可以使用酚、氯仿再次抽屉提高DNA的回收效率
（5） 氯仿中通常以24：1（V/V）的比例加入异丙醇，后者是一种消炮剂，我们发现当用温和手法倒转或是在转轮上转动管子的时候不存在产生泡沫问题，所以可以省略异丙醇
（6） DNA可以空气干燥，但是再次融解时间比较长
（7） 所用细胞数1。5×10(7)-2undefined10(7)
(二)DNA酶切
（1） 每一中酶有自己的适合的缓冲液，分别是高盐，中盐，低盐，使用时在待消化样品中加入终体积的1/10就可以了。错缓冲液会导致酶活力下降，酶切特意行改变甚至与活力完全消失
（2） 缓冲液 NACL(mmol/l)
trisHCL（PH7.5)
MGCL2 DTT
（3） 高盐 （4） 100 （5） 50 （6） 10 1
（7） 中盐 （8） 50 （9） 10 （10） 10 1
（11） 低盐 （12） 无 （13） 10 （14） 10 1
(3)可以使用通用buffer，但是有些情况酶活力会下降到最大活力的20％，这种通用缓冲液是谷氨酸甲盐和醋酸甲盐缓冲液，特别适合与需要两种完全不同系统的DNA切割试验
（4）待切割DNA的量取决与以后的试验步骤，如果是为了鉴定质粒DNA中是否插入片断，那么合适的酶切DNA的量约为500ng-1ug，当然酶切的DNA的量与插入片断的大小有关，插入片断越小酶切DNA的量就应该越大，只有这样才能在以后的电泳中观察到
（5）所切割的DNA应该有较高的纯度，DNA样品中不能存在如酚，氯仿，乙醇，盐，去污剂，已经契合机等杂质，就是痕量也会抑制酶的反应或是失活
（6）稳定低蛋白浓度的酶制剂以及防止变形，酶的反应体系应该加入BSA
(7)酶切必须使用高质量的灭菌水，水中不含有无机离子，有机化合物
（8）1个酶单位的定义：在最适合的温度与缓冲液的条件下，1h内完全切割1ug的标准的DNA所需要的量
（9）切割基因组DNA时候加入的亚精氨至浓度为1mmol/l能显著提高酶切效率，因为带正电荷的杂质结合，需要注意低温条件下亚精氨可使DNA沉淀，所以反应物至于冰上不能加入亚精氨
（10）实际使用的酶切最小体积是10ul
(11)不少酶对甘油敏感，如果甘油浓度超过10％会发生非特异性位点切割（称为星号活力），为了避免这种情况发生应加酶量控制在反应体积的比例为1：10 ，或是更低
（12）酶对热不稳定，必须马上至于冰箱
（13）大多数酶是在37度保温进行，但不是所有的酶都是如此，例如TAQ1为65度，所以使用前应先核对一下说明书
（14）无论什么体积的酶混合液都要避免漩涡振荡器的使用，这种操作会影响酶的活性，只要轻轻用手弹管壁进行混合，然后放在离心机中离心1－5S使得液体都集中在管子底部就可以了
（三）琼脂糖凝胶电泳
（1） 缓冲液
LE 高离子强度，不适合制备型电泳
甘氨酸 低离子强度，非常适合与制备型电泳，也可以用于分析电泳
TRIS-硼酸－EDTA 低离子强度，可以用于制备型或是分析型电泳
TRIS－醋酸－TAE 特别适合用于分析型和用玻璃柱纯化DNA片断得制备型电泳
注释：
（1） EB加入胶中或是缓冲液中进行电泳，而乐于在电泳后将胶染色，这是因为EB加入到胶中后会影响DNA得迁移，特别是当分子中有环装构型（超螺旋或是开环）得质粒时候。不过当有或是无EB得条件一致时就不会有什么困难了。使用EB遇到得第二个问题就是EB会促使紫外灯照射下得DNA得损伤（光切口），所以胶中或是缓冲液中含有EB得电泳，最好减少观察时间以防止DNA得损伤以后再次电泳形成模糊得条代
（2） 进行分析电泳得产生得最佳分辨率得电场强度约为10V/cm，如果DNA片断为5KB或是更大则采用5V/cm才能得到最佳分辨率，当DNA片断小于1KB时采用较高得电场强度通常也能得到较好得分辨率。
（四）souther 杂交
1．方法
（1）材料
1．尼龙杂交膜，毛细血管转移系统，脱飘令缓冲液（0.25mol/l HCL）,变性缓冲液：1.5mol/l NAcl,0.5mol/l naoh,转移缓冲液：1.5mol/Lnacl ,0.25mol/l naoh,2undefinedSSC:3mol/l NACL,0.3mol/l柠檬酸钠
（2）步骤
1．酶切DNA进行电泳分离
2．用干净刀片切去无用胶
3．将凝胶浸泡在约3倍体积得脱飘令缓冲液中，与室温缓慢摇动30min或是待胶中得溴芬兰变为黄色为止
4．倾泻除去脱飘令缓冲液，加入3倍体积得变性缓冲液，室温下轻轻摇动30min
5,倾泻除去变性缓冲液，加入3倍体积得转移缓冲液，室温下轻轻摇动30min,以利于平衡
6．将胶放在灌有转移缓冲液得毛细管转移装置平台上，转移装置如图
1KG
纸巾
3MM滤纸，杂交膜（分两层）
胶
塑料家
转移缓冲液
7．剪下一块与胶大小相同得尼龙膜漂浮与重蒸水水面上使之湿润，然后用转移缓冲液淋洗，将膜覆盖与胶上并赶走气泡
8将4张3MM滤纸剪成与胶同样大小，其中两张浸泡与转移液后覆盖与膜上，赶走所有气泡，另外两张干得至于两张湿的滤纸上部，然后在上层滤纸上放一叠干得纸巾，在纸巾得顶部压1g得重物，转移至少2h
9. 卸下转移装置，在凝胶与膜分离之前先在电样孔得位置坐上记号，如果是用铅笔做记号得话，就会在以后得放射自显影底片上出现记号，用2×SSC缓冲液淋洗膜后放在80度烘箱中烘烤20－60分钟
10. 用312nm的紫外灯投射灯可以使得DNA共价交联 与膜上，将膜得含DNA一面向下放在一片保险膜上与紫外灯下照射2－3min
与标准得DNA片断对照可以定出杂交条代得所显示得分子大小，最好是使用经放射性同位素标记得相对分子质量标准，这样在最后得放射自显
