【求助】引物设计14-3-3η的全长引物

谁能帮我设计一下14-3-3η的全长引物。需要加上酶切位点

正义链 XhoI CCG（保护碱基） CTC GAG

反义链 Xba CTAG（保护碱基） TCT AGA

14-3-3η的全长序列

其中 Cds 176..916

1 tgcagccagc tagcgagaag gcgcgagcgg cggcgcagcc agcagcctcc cgccagccgg

61 cgagccagtg cgcgtgcgcg gcggcggcct cggcggcgac cgggaagcgg acgggcgggc

121 gaggcgagcg aggcaggcgg tgcgggcgtg cgaggcgagg ccgatcgc gagcgacatggg

181 ggaccgagag cagctgctgc agcgggcgcg actggcggag caggcggagc gctacgacga

241 catggcctcc gccatgaagg cggtgacaga gctgaatgaa cctctatcta atgaagatag

301 aaatctcctc tctgtggcct acaagaatgt agttggtgcc aggcgatctt cttggagggt

361 tattagtagc attgagcaga aaaccatggc agatgggaat gagaagaagc tggagaaagt

421 caaagcctat cgggagaaga ttgagaagga gctggagaca gtttgcaatg atgtcttggc

481 tctgctcgac aagttcctta tcaagaactg caatgatttt cagtacgaga gcaaggtgtt

541 ctacctgaaa atgaagggcg attactaccg ctacctggca gaggtggctt ctggggagaa

601 gaaaaacagt gtggttgaag cttctgaggc agcgtataag gaagccttcg aaatcagcaa

661 agagcacatg cagccaacac accccatccg gcttggcctg gccctcaatt tttctgtgtt

721 ctactatgag atccagaatg caccagagca ggcctgcctc ttagccaaac aagccttcga

781 tgatgctata gctgagctgg acacattaaa cgaggattcc tataaggact ccactctcat

841 catgcagttg ctgcgagaca acctcaccct ctggacgagc gaccagcagg atgaagaagc

901 cggaga aggc aactgaagac ccatcaggtc cctggccctt cctttaccca ccacccccat

961 tatcactgat tcttccttgc cacaatcact atatctagtg ctaaacctat ctgtattggc

1021 agcacagcta ttcagatctg ccctcctgtc ccttggaagc agtttcagat aaaccttcat

1081 gggcatttgc tggactgatg gttgctttga gccacagagc gctccctttt tgaattgtgc

1141 agagaagtgt gttctgaacg aggcatttta ttatgtctgt tgatctgtag caaatccatg

1201 tgatggtaat tgagtgtaga aaggagaatt agccaacaca ggctatggct gctatttaaa

1261 acaagctgat agtgtgttgt taagcagtac atctcgtgca tgcaaaaatg aatttgaccc

1321 tctcacccct tctttcagct aatggaaact gacacacgac aacttgttcc ttcaccatca

1381 gctttataaa ctgtttctcg tgagctttca ggcccctgct gtgcctcttt aaattatgat

1441 gtgcgcacac cttcttttca atgcaatgca tcagaggttt ttgatatgtg taactttttt

1501 ttttggttgt gattaagaat catggattta ttttttgtaa ctctttggct attgttcttg

1561 tgtaccctga cagcatcatg tgtgtcaacc tgtgtcaatc atgatgggtg gttatgaaat

1621 gccagattgc taaaataaat gttttggact taaaaagagt aaataaatgc tgctttgggg

1681 atattaaaa

没有人能够帮个忙吗

根据你给出的序列，如果仅仅是克隆CDS区（ATG---TGA）的话，的确很难，因为5`端GC含量较高，3`端相对较低，上游引物和下游引物的温差>10℃。

如果好弄，我就不会求助了。
我现在设计了用另外的酶切位点

Sense: 5’ TTAG↓TCGACACATGGGGGACCGAGAG-3’

Sal I

Antisense: 5’ GTCC↓TCGAGATGGGTCTTCAGTTGCC-3’

XhoI

但是blast，如果两条都加进去ACATGGGGGACCGAGAGnnnnnnnnnnnnnATGGGTCTTCAGTTGCC，blast无结果

而如果只输入正义或反义，才会出来结果，但是感觉没有用。

你可以先设计引物扩一下试试，就从ORF部分设计就行了，上游取20个碱基，下游取21个碱基，然后加上酶切位点就行了， 这样的序列扩出来应该没有什么问题的。退火温度可以用59°或60°，对于这样的序列，引物部分根本没得选择的，你不试一下怎么知道扩不出来呢？

楼上同学说的对，没得选择。
除非你有再长一些的序列，可以前后多扩增一部分，寻找能适合设计引物的部分。
如果成功，这个片段里就带有cds，片段连T载体，之后阳性质粒做模板，进行亚克隆，就ok了