【求助】关于一种蛋白western的问题

哦，这个我知道，我现在主要是还做，同学都说实验失败就在于这个稀释的度，这个蛋白分子量很小，只有800多，都说跑不大出来，一般分子量都是1W多，请问分子量小的还可以用其他方法么？yangbxys wrote:
没有做过cyt C，但是做过WB。每次买抗体，都有说明书，说明书会告诉你比如做WB时出现条带的大小，已经建议的WB稀释浓度。建议lz好好看看说明书。

恩，谢谢~请问这个分子量很小是不是不大容易出图，只有800多，还有别的方法可以测出来么？


林杉201212 wrote:
1.抗体浓度：一般用说明书推荐的浓度稍稍高一点即可，如推荐1:1000，可用1:800；

谢谢，写得这么详细，我明白了许多~


yangbxys wrote:
分子量这么小，用的SDS-PAGE胶浓度大一点，15%，跑胶时间不用太长，看见溴酚蓝跑的分离胶的中或中下部就停了，marker应该有专门小分子量预染marker，你找试剂公司的人跟他们讲一下你的要求，一般他们会有合适推荐给你的。转膜条件得摸，可以先按照实验室经常用的转膜条件试一下，如果是实验室转膜的目的蛋白分子量比如40kd用2h，你可以用1个小时试一下，转完以后的SDS-PAGE胶可以放到考马斯亮蓝染液染一下，看看小分子量蛋白转的情况，一抗先按照说明书建议的最高浓度做，二抗按照你所在实验室一般使用的浓度用一下，ECL发光的时候先按照实验室常用的曝光时间看一下，如果片子出来没有东西，别着急，把曝光时间延长再试试，即使没有目的蛋白，曝光时间长的话杂带会出来，个人认为如果曝光时间很长比如10分钟或更长，杂带出来还没有目的条带，有可能是膜上面目的条带没有或者抗体不行，这个时候你那这个膜stripper处理然后做内参比如GAPDH，如果GAPDH出来条带了，那就是一抗的问题或者目的蛋白不在膜上。最好做的时候，能带个阳性对照，这个可以肯定是抗体的问题还是样品的问题。总之，自己慢慢摸条件查查资料别着急，多向实验室的技术人员咨询，查资料看看别人怎么做的。