【求助】磷酸化的Akt不见了！！

这俩天做实验，极其郁闷。我做的总AKt和pAkt,大鼠脑组织，第一次跑总AKT的时候，我觉得可能是因为蛋白是提取的浓度比较好吧，出来了一条浓浓的条带，三组总AKt都出了，接下来做pAkt,就出了一个带，效果挺明显的。后来再做pAkt的时候，跑了4张膜，显影的时候，太干净了，上面什么都没有，甚至连个杂带，斑点 都没！实验是在实验员的领导下完成的，技术上基本没什么纰漏，查阅本版面有关这问题方面的介绍，有的解释说pakt降解了！一抗是用的Phospho-Akt(Ser473)(193H12)Rabbit mAb，1:300,稀释，二抗是驴抗兔，1：2000，我是实验室的新手，刚呆俩月，受 此挫折，一头雾水，请过来人或者有经验的同学帮忙解答怎样解决，非常感谢！

pAkt有两个位点，Ser473和Thr308，其中Ser473相对容易显色。如果显色失败，可能的原因:1 上样量过少，我们一般都是30μg；2 一抗孵育时间过短，我们一般24h~48h；3 一抗是否工作有待排除

我上样量上的15ug，一抗孵育大约18个小时，就是头天下午孵育上，第二天早上就洗膜了，之前做过一次pakt,一样的过程，出了一次，再以后就没出了。今天我们换了下不同组的同一组织，比较新，试下，不知道明天出不出结果。。。

换了新蛋白，还是没出结果。我们连做了3次，第4次跑了俩胶，一块胶还用原来的旧2抗，是进口2抗，另外一块胶借了点同学的国产2抗，结果是国产2抗那个结果出了，进口2抗那个没出结果，和前3次一样，漆黑一片。原来是我们的2抗失效了。简直给我们坑苦了！新的2抗还在路上，预计一个月到达。所有有关实验暂停！简直郁闷！

二抗怎么会要一个月，我们的今天打电话明天就到

你好，你们在哪订的抗体啊，我们订的进口抗体。。

国产的 也至少一个礼拜吧。。
关键 我老板不用国产的，坑苦了。。

有些抗体有现货，有些抗体没有现货，需要订购。

只有等着了。。

中山金桥，北京的，他们的二抗也是jakson分装的，我个人觉得二抗没有那么关键。

今天做上了。。问公司要了点进口分装的。。明天看出不出结果了。。晕

出结果了！结果条带比较杂，但是p-akt还是比较清楚的！另外，出现诡异现象就是，无法解释！糖尿病组胰岛素信号通路IRS-1位点是上调，而出现的p-akt 丝氨酸位点是下调表达，怎么解释这个现象呢？迷糊

Akt 和p-akt 全部做完了 哈哈

您好！两者是什么趋势呢，是总的差不多，磷酸化的降低吗？谢谢！
我最近也在做着两个，真的好难做啊！

请问下各位大哥大姐，经费有限可以省去总的Akt吗？谢谢啦