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【求助】Western blot 的阳性对照

丁香园论坛

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各位,我的实验最近遇到了问题,检测一个趋化因子,Western 重复性很差,只有蛋白上样量接近200ug的时候才能勉勉强强看到很弱的条带,并且杂带很多。师兄建议让公司合成纯化蛋白。但问题是原核表达的蛋白分子量35kDa,在真核系统里,这个蛋白质高度糖基化,分子量可达到60kD。在这种情况下,如何构建阳性对照呢?
~undefined*解答
换成单克隆抗体应该特异性更好些。

另外,你不能用与实验动物相同种属的2抗,就是如果你的sample来自于mouse,你的2抗最好别用mouse的,用兔的试试应该更好。

再有,如果你的趋化因子是分泌性的,建议用ELISA试试。
magichunter wrote:
换成单克隆抗体应该特异性更好些。

另外,你不能用与实验动物相同种属的2抗,就是如果你的sample来自于mouse,你的2抗最好别用mouse的,用兔的试试应该更好。

再有,如果你的趋化因子是分泌性的,建议用ELISA试试。

谢谢你的建议

我的sample是人乳腺癌细胞的蛋白,一抗为羊抗人,二抗为兔抗羊,跟你提的建议一致,问题在该趋化因子的单抗从来都没用于实验,不敢买,
这个趋化因子包括跨膜型和分泌性两种,分泌性的我用ELISA测过,结果跟预期相符,但我的课题主要关注的是跨膜型的所以得把Western blot 做好

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师兄微信号:shixiongcoming

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