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【求助】转染后有mRNA没有蛋白表达

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我在尝试转染某种细胞,载体是购买的商业载体(pCMV6),之前转染HEK293作为预实验,已经用WB证明有效,但是换到现在这种细胞之后就很奇怪,一开始想用短期转,结果WB做不出来,觉得可能是转染率太低,于是又改做稳定转染,用了G418筛选。花了近2个月,细胞稳定下来了,取样做RT-PCR,有相当强的mRNA表达(-RT和对照组转染也做了的,基本没有带,所以不会是污染),谁知做WB还是一点东西都没有……我都快疯了,既然能抗G418,又有大量mRNA,为什么还会没蛋白呢?细胞本身是有点太老了,已经100多代(汗),但之前师姐也用它做出了稳定转染,所以应该是可行的吧……
目前导师是建议用IP和免疫荧光看看能不能有点东西,但我觉得以那么强的mRNA表达,WB做不出来真的说不过去,怕之后的实验希望也不大……总之请大虾们指点一二,无论是原因分析还是后续补救都行,先深深谢过了!
你用的什么载体啊?稳定转染的?怎么用G418筛选啊,费时费力,直接病毒转
之前转染HEK293作为预实验,已经用WB证明有效,你之后的wb有没阳性对照呢或者说用HEK293作为对照呢
chenhaombb wrote:
你用的什么载体啊?稳定转染的?怎么用G418筛选啊,费时费力,直接病毒转

用的pCMV6Entry,已经是慢病毒载体了……就是因为这种细胞转染率太低(据师姐说大概15%)不得已才做稳定转染,想说看看能不能让转染率上来一点,结果还是测不到蛋白……

baby_susan wrote:
之前转染HEK293作为预实验,已经用WB证明有效,你之后的wb有没阳性对照呢或者说用HEK293作为对照呢

有啊,之后WB就是用之前的HEK293做的阳性对照,还用的两种一抗,HEK的带都出来了,但这种细胞啥都没有……
不对啊,慢病毒是转2次,第一次收毒第二次转细胞,第二次转染效率很高的啊。
chenhaombb wrote:
不对啊,慢病毒是转2次,第一次收毒第二次转细胞,第二次转染效率很高的啊。


抱歉,是我弄错了,汗……自己是刚接触这些的菜鸟,概念还没怎么弄清……载体图谱是这个样子:



转染效果应该还不错的,现在我怕的就是如果IP和免疫荧光做下来没东西,那转染效率再高也没用,蛋白不肯表达啊……
birkin wrote:
抱歉,是我弄错了,汗……自己是刚接触这些的菜鸟,概念还没怎么弄清……载体图谱是这个样子:



转染效果应该还不错的,现在我怕的就是如果IP和免疫荧光做下来没东西,那转染效率再高也没用,蛋白不肯表达啊……


你的基因是什么物种?转的什么细胞?
chenhaombb wrote:
你的基因是什么物种?转的什么细胞?

基因是人类基因,细胞也是人类细胞,由生殖系统肿瘤衍生的细胞系……
第一次磷酸钙转染HEK293T,收取病毒,第二次病毒转染目的细胞。我觉得你先查查读码框是不是正确吧。
不明miRNA大举进攻楼主的蛋白
chenhaombb wrote:
第一次磷酸钙转染HEK293T,收取病毒,第二次病毒转染目的细胞。我觉得你先查查读码框是不是正确吧。

是吗……我知道了,回去试试看,多谢指点~~~

LoftyMan wrote:
不明miRNA大举进攻楼主的蛋白

55,不是吧,要真是这样我整个接下来的计划都全泡汤了说……
现在你的实验怎么样了?我马上要转染的表达载体就是pCMV6,也是买来的商品化产品
birkin wrote:
我在尝试转染某种细胞,载体是购买的商业载体(pCMV6),之前转染HEK293作为预实验,已经用WB证明有效,但是换到现在这种细胞之后就很奇怪,一开始想用短期转,结果WB做不出来,觉得可能是转染率太低,于是又改做稳定转染,用了G418筛选。花了近2个月,细胞稳定下来了,取样做RT-PCR,有相当强的mRNA表达(-RT和对照组转染也做了的,基本没有带,所以不会是污染),谁知做WB还是一点东西都没有……我都快疯了,既然能抗G418,又有大量mRNA,为什么还会没蛋白呢?细胞本身是有点太老了,已经100多代(汗),但之前师姐也用它做出了稳定转染,所以应该是可行的吧……
目前导师是建议用IP和免疫荧光看看能不能有点东西,但我觉得以那么强的mRNA表达,WB做不出来真的说不过去,怕之后的实验希望也不大……总之请大虾们指点一二,无论是原因分析还是后续补救都行,先深深谢过了!

移码突变了吧
加阳性对照啊
wuyihong20100820 wrote:
现在你的实验怎么样了?我马上要转染的表达载体就是pCMV6,也是买来的商品化产品
我后来换了师兄的载体做出来了,但原因似乎不在载体,是我这个细胞系的问题,因为那个公司把人类生长激素的3’非编码区应用在这个载体上,而之前有报道,我这种细胞正好在人生长激素的表达有问题(没有细查原理,估计是miRNA的问题),所以我的载体也被连累了……你如果怕出现我这种问题,可以查查看买来载体的序列(公司网站应该有的),看3’非编码区是来源于什么基因(想找这个区,线索就是polyA尾巴+终止密码子,找到疑似的序列就丢进BLAST看有没有对应),这种基因在你的细胞里表达有没有问题,而且其实短转+WB也就一个星期的事儿,你大可以先做做看,有问题再排查~~~

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