【求助】转染后有mRNA没有蛋白表达
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我在尝试转染某种细胞，载体是购买的商业载体（pCMV6)，之前转染HEK293作为预实验，已经用WB证明有效，但是换到现在这种细胞之后就很奇怪，一开始想用短期转，结果WB做不出来，觉得可能是转染率太低，于是又改做稳定转染，用了G418筛选。花了近2个月，细胞稳定下来了，取样做RT-PCR，有相当强的mRNA表达（-RT和对照组转染也做了的，基本没有带，所以不会是污染），谁知做WB还是一点东西都没有……我都快疯了，既然能抗G418，又有大量mRNA，为什么还会没蛋白呢？细胞本身是有点太老了，已经100多代（汗），但之前师姐也用它做出了稳定转染，所以应该是可行的吧……
目前导师是建议用IP和免疫荧光看看能不能有点东西，但我觉得以那么强的mRNA表达，WB做不出来真的说不过去，怕之后的实验希望也不大……总之请大虾们指点一二，无论是原因分析还是后续补救都行，先深深谢过了！
目前导师是建议用IP和免疫荧光看看能不能有点东西，但我觉得以那么强的mRNA表达，WB做不出来真的说不过去，怕之后的实验希望也不大……总之请大虾们指点一二，无论是原因分析还是后续补救都行，先深深谢过了！
你用的什么载体啊？稳定转染的？怎么用G418筛选啊，费时费力，直接病毒转
之前转染HEK293作为预实验，已经用WB证明有效，你之后的wb有没阳性对照呢或者说用HEK293作为对照呢
chenhaombb wrote:
你用的什么载体啊？稳定转染的？怎么用G418筛选啊，费时费力，直接病毒转
用的pCMV6Entry，已经是慢病毒载体了……就是因为这种细胞转染率太低（据师姐说大概15%）不得已才做稳定转染，想说看看能不能让转染率上来一点，结果还是测不到蛋白……
baby_susan wrote:
之前转染HEK293作为预实验，已经用WB证明有效，你之后的wb有没阳性对照呢或者说用HEK293作为对照呢
有啊，之后WB就是用之前的HEK293做的阳性对照，还用的两种一抗，HEK的带都出来了，但这种细胞啥都没有……
不对啊，慢病毒是转2次，第一次收毒第二次转细胞，第二次转染效率很高的啊。
chenhaombb wrote:
不对啊，慢病毒是转2次，第一次收毒第二次转细胞，第二次转染效率很高的啊。
抱歉，是我弄错了，汗……自己是刚接触这些的菜鸟，概念还没怎么弄清……载体图谱是这个样子：
转染效果应该还不错的，现在我怕的就是如果IP和免疫荧光做下来没东西，那转染效率再高也没用，蛋白不肯表达啊……
birkin wrote:
抱歉，是我弄错了，汗……自己是刚接触这些的菜鸟，概念还没怎么弄清……载体图谱是这个样子：
转染效果应该还不错的，现在我怕的就是如果IP和免疫荧光做下来没东西，那转染效率再高也没用，蛋白不肯表达啊……
你的基因是什么物种？转的什么细胞？
chenhaombb wrote:
你的基因是什么物种？转的什么细胞？
基因是人类基因，细胞也是人类细胞，由生殖系统肿瘤衍生的细胞系……
第一次磷酸钙转染HEK293T，收取病毒，第二次病毒转染目的细胞。我觉得你先查查读码框是不是正确吧。
不明miRNA大举进攻楼主的蛋白
chenhaombb wrote:
第一次磷酸钙转染HEK293T，收取病毒，第二次病毒转染目的细胞。我觉得你先查查读码框是不是正确吧。
是吗……我知道了，回去试试看，多谢指点~~~
LoftyMan wrote:
不明miRNA大举进攻楼主的蛋白
55，不是吧，要真是这样我整个接下来的计划都全泡汤了说……
现在你的实验怎么样了？我马上要转染的表达载体就是pCMV6，也是买来的商品化产品
birkin wrote:
我在尝试转染某种细胞，载体是购买的商业载体（pCMV6)，之前转染HEK293作为预实验，已经用WB证明有效，但是换到现在这种细胞之后就很奇怪，一开始想用短期转，结果WB做不出来，觉得可能是转染率太低，于是又改做稳定转染，用了G418筛选。花了近2个月，细胞稳定下来了，取样做RT-PCR，有相当强的mRNA表达（-RT和对照组转染也做了的，基本没有带，所以不会是污染），谁知做WB还是一点东西都没有……我都快疯了，既然能抗G418，又有大量mRNA，为什么还会没蛋白呢？细胞本身是有点太老了，已经100多代（汗），但之前师姐也用它做出了稳定转染，所以应该是可行的吧……
目前导师是建议用IP和免疫荧光看看能不能有点东西，但我觉得以那么强的mRNA表达，WB做不出来真的说不过去，怕之后的实验希望也不大……总之请大虾们指点一二，无论是原因分析还是后续补救都行，先深深谢过了！
移码突变了吧
加阳性对照啊
wuyihong20100820 wrote:
现在你的实验怎么样了？我马上要转染的表达载体就是pCMV6，也是买来的商品化产品
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