基本方案 用于表达监测以及与寡核苷酸芯片杂交的 mRNA 扩增

1. 实验前准备

1.1 材料

样品 RNA：poly（A）^＋或总 RNA，有义转录库对照

1.2 试剂

SuperScript cDNA kit （Life Techologies）

T7T24引物

RNA 酶抑制剂（Life Technologies 或 Ambion 公司）

无 RNA 酶水（DEPC处理过的水，玻璃蒸馏）

25：24：1 （V/V/V）酚：氯仿：异戊醇（分子生物学级）

7.5 mol/L 乙酸铵 无水乙醇

无 RNA 酶的 70％ 乙醇（预冷至 -20℃）

10×转录缓冲液（Ambion）

10×rNTP 混合液

100 mmol/L DTT

10 mmol/L Bio－ll－CTP 和 Bioll－UTP （Enzo Diagnostics）

2500 U/ul T7 RNA 聚合酶（Epicentre）

RNeasy 小柱带RLT和RPE 缓冲液及收集管（Qiagen）

5×片段化缓冲液

20×SSPE （Bio－Wh1ttaker）

0.5％ （V/V） Triton X－100 （分子生物学级；Sigma）溶于无 RNA 酶水

10 mg/ml 鲱精 DNA （Promega）

500 pmol/L Bio948

20×反义转录库对照

6×SSPET： 6×SSPE 含有 0.005％ （V/V） Triton X－100

1.3 耗材

热循环仪（例如 Perkin－Elmer 公司 9600 型 PCR 仪，带热盖）

0.1～10 ul 带滤芯枪头（Continental）

Lyophilizer （冻干机）

小薄壁PCR管

GeneChip （Affymetrix）

1～200 ul 带滤芯凝胶上样枪头（Fisher）

Rotisserie 式摇床（Appropriate Technical Resources）

50℃ 加热炉

2. 在 PCR仪上设定下列程序：

10 min 70℃

65 min 37℃ （用总 RNA 时 50℃）

150 min 15.8℃

无限 4℃ （保温）

3. 用下列试剂为每个RNA 样品配 10 ul 第一链混合液，用带滤芯的枪头：

4 ul 5×第一链缓冲液

200 pmol T7T24 引物

1 ul RNA 酶抑制剂

1 ul 200 U/ul SuperScript Ⅱ 逆转录酶

加无 RNA 酶的水至 10 ul

4. 将每个RNA样品与有义转录库对照混合。每 1 ug poly（A）^＋样品加 5 ul 对照或每 10～20 总 RNA 加 1 ml 对照。冷冻干燥至每管体积小于 10 ul， 加无 RNA 酶的水 至10 ul。同时用手预热第一链混合液。

5. 将每份 RNA 转移到小薄壁 PCR 管中，放进 PCR 仪，启动所设程序（第一步）。

6. 70℃ 那步完成后，在温度降到 37℃（或 50℃）2 min 的时间里，加入预热（手中）的第一链混合液（每管 10 ul）。

7. 在合适的反应温度继续保温60 min。

8. 每管配制 130 ul 第二链反应混合液：

91 ul 无 RNA 酶的水

30 ul 5×第二链缓冲液

3 ul 10 mmol/L dNTP

1 ul 10 U/ul E.coli 连接酶

1 ul 2 U/ul E.coli RNA 酶 H

4 ul 10 U/ul E.coli DNA 聚合酶

这个混合液可以先配制，在冰上至多放置 90 min。

9.当 PCR 仪温度降到 15.8℃ 时，每管加入 130 ul 第二链反应混合液（总共 150 ul）。用枪头反复吸放混匀，在此温度下保温＞2h。

10. 加入 2 ul 5 U/ul 的 T4 DNA 聚合酶继续保温 5 min。把样品转移到冰上。

11. 加入 150 ul 25：24：1 的酸：氯仿：异戊醇，涡旋混匀，室温 13 000 g 离心 5 min。

12. 小心地将水相转移到一个新的管子，不要吸到中间相。加入 70 ul 7.5 mol/L 乙酸铵和 0.5 ml 无水乙醇后混匀。室温 13 000 g 离心 20 min。

13. 移去上清，沉淀用 0.5 ml 冷（-20℃） 70％ 乙醇洗涤，涡旋混合。

14. 室温 13 000 g 离心 10 min。移去上清，沉淀空气晾干几分钟。

15. 用 25 无 RNA 酶的水溶解 cDNA 沉淀并定量。

16. 每种 cDNA 样品，按下面组分配制一个反应体系：

100 ng cDNA

6 ul 10×转录缓冲液

6 ul 10×rNTP混合液

3 ul 100 mmol/L DTT

2.4 ul 10 mmol/L Bio－ll－UTP

2.4 ul 10 mmol/L Bio－ll－CTP

2 ul RNA酶抑制剂

2 ul 2500 U/ ul T7 RNA 聚合酶

无 RNA 酶的水配平到 60 ul

冰上可以放至多 3 h，用前升温到室温。

17. 37℃ 保温 8 h 至过夜。纯化前可以在 -80℃ 放置至多 48 h。

18. 加入无 RNA 酶水至 100 ul， 加入 350 ul RLT 缓冲液，混匀。加入 250 ul 无水乙醇，混匀。

19. 将每个样品上样到一个套进收集管内的 RNeasy小柱上。台式离心机室温 8000 g 以上离心 15 s。

20. 将柱子转到新的收集管，加入 500 RPE 缓冲液，台式离心机室温 8000 g 以上离 心 15 s。

21. 弃去流出液，将柱子重新放入此收集管。加入 500 ul RPE 缓冲液，台式离心机以最大速度离心 2 min。

22. 把柱子转移到一个新收集管。加入 50 ul 无 RNA 酶的水，8000 g 以上离心 1 min。 重复此步骤。合并两次洗脱液。

23. 在 260 nm 用分光光度法测 RNA 的量。

24. 取 10 体外转录的 RNA 用无RNA酶的水将体积配到 24 ul。加入 6 ul 5×片段化缓冲液。小心混匀，在 PCR 仪上 95℃ 温育 35 min。令其冷却到室温。-80℃ 可存放一年，用前 37℃ 融化 5 min。

25. 按下列组分为每个反应配 170 ul 杂交反应母液：

51 ul 20×SSPE

1.7 ul 0.5％ Triton X－100

1.7 ul 10 mg/ml 鲱精 DNA

20 ul 500 pmol/L Bio 948

10 ul 20×反义转录库对照

85.6 ul 无 RNA 酶的水

26. 每份 30 ul 片段化的转录 RNA 加入 170 ul 杂交反应母液。在热循环仪上以 99℃ 加热 10 min， 再移到 37℃放置 5 min 以上。

27. 微量离心机最大转速离心 5 min。

28. 从 GeneChip 的上层隔膜插入一个带滤芯的枪头形成出气孔。从芯片的下层隔膜用带滤芯的上样枪头加入 200 ul 杂交液。拿掉出气孔，用保鲜膜覆盖上下两层。

29. 在 rotisserie 式旋转仪上以 60 r/min 转速 40℃ 保温过夜（16～18 h）。

30. 将芯片转入 50℃ 加热炉，继续旋转芯片整整 1 h。

31. 从炉内拿出芯片。从上层隔膜处插入带滤芯的枪头。

32. 微量移液器按到底，将 200 ul 上样枪头从下层隔膜间插入。垂直拿起芯片，缓慢抽出所有杂交液并放进微量离心管内保存于 -20℃。

33. 将芯片内充满 6×SSPRET。

34. 按厂商的说明书洗涤芯片并用藻红素染色。尽快扫描芯片。

1. 许多缓冲液和酶附带在 SuperScript cDNA 试剂盒里。附带的酶量不足的话可以单独从 Life Technologies 公司定购。

2. 所有需要控制温度的反应都在适当的热循环仪上进行。