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【求助】关于细胞凋亡PCR技术

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最近的实验想从细胞中提取RNA,然后进行逆转录PCR从而测定细胞中bcl-2的表达,进而探讨凋亡的机制。可是该过程中遇到一棘手问题:我对细胞进行干预后,按照trizol试剂盒提取RNA说明,加入trizol液之前要先吸去培养液;然而,此过程中肯定不可避免地将凋亡细胞吸掉了,那么请问各位前辈,这样做的话是否会影响后续结果,从而影响对RNA表达的误判呢?还有一点,请问bcl-2,caspase-3是只在活细胞(进入凋亡程序的细胞)中表达么,已经凋亡的细胞是否仍有表达?查阅了很多文献,还是没有搞清楚,请各位前辈不吝赐教~~
你可以通过收集培养板里的细胞,然后离心的方法去掉培养液,然后再裂解细胞,这样就不会去掉凋亡的细胞了。
活细胞发生凋亡是一个连续的变化过程,你应该从动态发展的角度去理解这个过程。
像活化的caspase3在早期的凋亡细胞中表达。Bcl-2在凋亡细胞中也是有表达的。一般认为,检测到活化的caspase3的细胞就是凋亡细胞了,而不是活细胞。
kern6549 wrote:
你可以通过收集培养板里的细胞,然后离心的方法去掉培养液,然后再裂解细胞,这样就不会去掉凋亡的细胞了。
活细胞发生凋亡是一个连续的变化过程,你应该从动态发展的角度去理解这个过程。
像活化的caspase3在早期的凋亡细胞中表达。Bcl-2在凋亡细胞中也是有表达的。一般认为,检测到活化的caspase3的细胞就是凋亡细胞了,而不是活细胞。

请问kern6549战友,如果我想做通路,做了PCR,还需要做western吗?谢谢
做通路最好不要用PCR,而是选择western。
因为RT-PCR检测到的结果只能说明细胞转录了这个蛋白,但是是否翻译了这个蛋白,你不知道。而且,RT-PCR的结果也不能反应细胞内该蛋白的量。另外,通路中很多都是激酶,该激酶是否发生作用与其细胞内表达的量很多是没有直接关系的,而是与其磷酸化的量密切相关,RT-PCR更不能反映这一点。而Western可以直接检测磷酸化的蛋白。
另外,流式细胞术也可以检测磷酸化的信号分子,可以作为Western法的一个补充。
kern6549 wrote:
做通路最好不要用PCR,而是选择western。
因为RT-PCR检测到的结果只能说明细胞转录了这个蛋白,但是是否翻译了这个蛋白,你不知道。而且,RT-PCR的结果也不能反应细胞内该蛋白的量。另外,通路中很多都是激酶,该激酶是否发生作用与其细胞内表达的量很多是没有直接关系的,而是与其磷酸化的量密切相关,RT-PCR更不能反映这一点。而Western可以直接检测磷酸化的蛋白。
另外,流式细胞术也可以检测磷酸化的信号分子,可以作为Western法的一个补充。

非常感谢kern6549战友的回答,呵呵,还是不太想做western啊,不好做,谢谢。

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