【求助】关于细胞凋亡PCR技术
丁香园论坛
3288
最近的实验想从细胞中提取RNA，然后进行逆转录PCR从而测定细胞中bcl-2的表达，进而探讨凋亡的机制。可是该过程中遇到一棘手问题：我对细胞进行干预后，按照trizol试剂盒提取RNA说明，加入trizol液之前要先吸去培养液；然而，此过程中肯定不可避免地将凋亡细胞吸掉了，那么请问各位前辈，这样做的话是否会影响后续结果，从而影响对RNA表达的误判呢？还有一点，请问bcl-2，caspase-3是只在活细胞（进入凋亡程序的细胞）中表达么，已经凋亡的细胞是否仍有表达？查阅了很多文献，还是没有搞清楚，请各位前辈不吝赐教~~
你可以通过收集培养板里的细胞，然后离心的方法去掉培养液，然后再裂解细胞，这样就不会去掉凋亡的细胞了。
活细胞发生凋亡是一个连续的变化过程，你应该从动态发展的角度去理解这个过程。
像活化的caspase3在早期的凋亡细胞中表达。Bcl-2在凋亡细胞中也是有表达的。一般认为，检测到活化的caspase3的细胞就是凋亡细胞了，而不是活细胞。
活细胞发生凋亡是一个连续的变化过程，你应该从动态发展的角度去理解这个过程。
像活化的caspase3在早期的凋亡细胞中表达。Bcl-2在凋亡细胞中也是有表达的。一般认为，检测到活化的caspase3的细胞就是凋亡细胞了，而不是活细胞。
kern6549 wrote:
你可以通过收集培养板里的细胞，然后离心的方法去掉培养液，然后再裂解细胞，这样就不会去掉凋亡的细胞了。
活细胞发生凋亡是一个连续的变化过程，你应该从动态发展的角度去理解这个过程。
像活化的caspase3在早期的凋亡细胞中表达。Bcl-2在凋亡细胞中也是有表达的。一般认为，检测到活化的caspase3的细胞就是凋亡细胞了，而不是活细胞。
请问kern6549战友，如果我想做通路，做了PCR，还需要做western吗？谢谢
做通路最好不要用PCR，而是选择western。
因为RT-PCR检测到的结果只能说明细胞转录了这个蛋白，但是是否翻译了这个蛋白，你不知道。而且，RT-PCR的结果也不能反应细胞内该蛋白的量。另外，通路中很多都是激酶，该激酶是否发生作用与其细胞内表达的量很多是没有直接关系的，而是与其磷酸化的量密切相关，RT-PCR更不能反映这一点。而Western可以直接检测磷酸化的蛋白。
另外，流式细胞术也可以检测磷酸化的信号分子，可以作为Western法的一个补充。
因为RT-PCR检测到的结果只能说明细胞转录了这个蛋白，但是是否翻译了这个蛋白，你不知道。而且，RT-PCR的结果也不能反应细胞内该蛋白的量。另外，通路中很多都是激酶，该激酶是否发生作用与其细胞内表达的量很多是没有直接关系的，而是与其磷酸化的量密切相关，RT-PCR更不能反映这一点。而Western可以直接检测磷酸化的蛋白。
另外，流式细胞术也可以检测磷酸化的信号分子，可以作为Western法的一个补充。
kern6549 wrote:
做通路最好不要用PCR，而是选择western。
因为RT-PCR检测到的结果只能说明细胞转录了这个蛋白，但是是否翻译了这个蛋白，你不知道。而且，RT-PCR的结果也不能反应细胞内该蛋白的量。另外，通路中很多都是激酶，该激酶是否发生作用与其细胞内表达的量很多是没有直接关系的，而是与其磷酸化的量密切相关，RT-PCR更不能反映这一点。而Western可以直接检测磷酸化的蛋白。
另外，流式细胞术也可以检测磷酸化的信号分子，可以作为Western法的一个补充。
非常感谢kern6549战友的回答，呵呵，还是不太想做western啊，不好做，谢谢。
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴
师兄微信号：shixiongcoming
