【求助】胰酶和血清是否影响p-akt表达？

最近想用western blot检测小胶质细胞活化后细胞内p-Akt表达情况（包括时间点），那么提蛋白时可否用胰酶消化的方法？加药前是否要将完全培养液换成无血清培养液？

Q1. 提蛋白时可否的方法？
A1.: 不要用胰酶消化， 贴壁细胞处理后，立刻至于冰上，用PBS洗三次后，直接加lysis buffer裂解提蛋白，lysis buffer的组分可查查文献，或在本版搜一下。
Ｑ２加药前？
视情况而定，一般不必要加，但ＬＺ需要查文献，看别人类似的工作是如何处理的，因为是否要将完全培养液换成无血清培养液，需要根据实验目的而定的。

我也想过了原位直接提蛋白，但总怕裂解的不充分，不知如何操作。我们裂解液买的是碧云天的RIPA，6孔板 150ul/孔，加入裂解液后要如何操作呢，不断晃动孔板，还是...?还买了细胞刮，是裂解完事后用的？

因为PI-3K-Akt是较经典的细胞存活通路，各种各样的生长因子通过该通路促进细胞生长等，而血清中恰好含有这些生长因子，所以怕血清中的这些成分造成干扰，才想到要换成无血清培养液，但不知细胞能不能活。文献中关于这方面的说明也蛮少的，我想如果细胞在无血清的条件下能生长的话，最好还是换成无血清培养液过夜。

放心用含有血清的完全培养基养。6孔板每个孔加60微升裂解液足矣，用细胞刮子推。

用碧云天的IP蛋白裂解液可将贴壁细胞裂解，wb杂交也没觉得有问题。
有文献报道，加生长因子刺激前12-18小时用血清饥饿才能更好的检测P-Akt,只是有的细胞对血清饥饿比较敏感，不适用该方法。