胰酶消化法
最新修订时间：
原理
将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
材料与仪器
SD大鼠
戊巴比妥钠 小牛血清 DMEM 酶消化液 D-Hanks' 液 酚红 台盼兰 HBSS 氯化钠 PBS
手术刀 手术剪 尼龙网 相差显微镜 荧光显微镜
戊巴比妥钠 小牛血清 DMEM 酶消化液 D-Hanks' 液 酚红 台盼兰 HBSS 氯化钠 PBS
手术刀 手术剪 尼龙网 相差显微镜 荧光显微镜
步骤
一、实验材料准备
1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
1. 动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
2. 试剂：戊巴比妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红 0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。
3. 器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
二、原代培养方法
1. 大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
2. 待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。
3. 以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。
4. 以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
三、传代方法
弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
四、 结果
接种次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。附上发表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(图1)。
注意事项
1. 进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin和α-SMA；后者在细胞激活后才表达。
2. 采用无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！实验采用原代培养的或传代后9代内的细胞(最好5代以内)。
2. 采用无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！实验采用原代培养的或传代后9代内的细胞(最好5代以内)。
常见问题
一、参考文献
1. 袁桃霞，张锦生，张月娥，等. 大鼠肝Ito细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学学报 1996;23(2):90-93.
2. Huang GC, Zhang JS, Tang QQ. Involvement of C/EBP-α gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun 2004;324(4):1309-1318.
来源：丁香实验
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