【求助】荧光素酶如何检测某基因为miRNA的靶基因?
丁香园论坛
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搜了一下论坛,未果,我想问一下,使用荧光素酶如何检测某基因为miRNA的靶基因?大概是什么样的步骤呢?才接触,也不了解
谢谢!您发的帖子我看到了,您的意思是现在常用的方法就是您帖子上写的吗?我看有的文献说看转了片段的荧光素酶载体的活性,如果活性低说明miRNA与靶基因相互作用,这个和您说的方法是一种吗?
另外,插入片段的psiCHECK2-Dual luciferase reporter vector、microRNA的precursor(Gain of function)和Inhibitors(Loss of function)三者必须都要吗?直接通过共转microRNA的precursor与插入片段的psiCHECK2-Dual luciferase reporter vector,然后看luciferase活性是否降低可以吗?使用Inhibitors是做什么用的呢?
另外,插入片段的psiCHECK2-Dual luciferase reporter vector、microRNA的precursor(Gain of function)和Inhibitors(Loss of function)三者必须都要吗?直接通过共转microRNA的precursor与插入片段的psiCHECK2-Dual luciferase reporter vector,然后看luciferase活性是否降低可以吗?使用Inhibitors是做什么用的呢?
一般就是通过把seed sequence(来自于候选靶基因)克隆在荧光素酶的下游,如果microRNA能够作用于该seed sequence的话,就可以降解该融合mRNA,导致荧光素酶的活性下降,否则不会有什么明显的作用。precursor相当于认为的合成的MicroRNA,因为有时候细胞中的水平很低,而Inhibitor则作用相反,可以抑制天然的MicroRNA的作用。你可以选择本底很低的细胞系共转载体和Precursor,选择本底比较高的共转载体和Inhibitor,当然肯定要设立载体单转和空载体转染的对照作为阴性对照,理论的seed sequence共转作为阳性对照。
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