【求助】全基因组甲基化状态的实验方法
丁香园论坛
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各位大侠，小弟现在做的实验需要进行全基因组甲基化状态的测定，有谁知道有没有这方面的试剂盒吗，或者大家都选择什么方法进行这种实验？
为了定量测定人基因组中的甲基化，哈佛大学的 George Church等，以及加州大学的Kun Zhang连同弗吉尼亚联邦大学的Yuan Gao等，将传统的甲基化工具如DNA的重亚硫酸盐转化与近期开发的目标基因组捕获技术和高通量测序相结合。
两个小组都利用了锁式探针（padlock probe）来富集基因组的选定部分。这些线性的寡核苷酸探针经过专门设计，每一端都与目标基因组的一侧杂交，DNA聚合酶随后在捕获区域延伸，经过最后的连接步骤，扩增得到环状的DNA并测序。
之前，Church和他的同事Jay Shendure已经利用锁式探针来捕获外显子；尽管这些探针是目标区域高度特异的，但它们仍表现出等位基因偏向性高和重复性差。Shendure的小组现在已经解决了这些问题，但利用重亚硫酸盐DNA的锁式探针还面临着另一个挑战：在重亚硫酸盐转化时，所有的甲基胞嘧啶转化成尿嘧啶，随后变成胸腺嘧啶，从而降低了序列的复杂度，但设计特异的探针变得更加困难。Zhang的小组与Church的小组都优化了捕获步骤，包括探针设计。
为了得到甲基化组（methylome）的整体图谱，Church及同事们将探针靶定在选定的基因组区域，而不管该区域是否富集CpG二核苷酸，并用一种甲基化敏感的酶进行消化，随后用基因组范围的切割计数来补充目标富集。在对成纤维细胞和诱导多能干细胞（iPSC）等几种细胞系进行分析后，他们发现基因表达与启动子区域的甲基化关联呈阴性，而与基因本身的甲基化呈阳性相关。Church确信这是生物学高度相关的。为了进一步证实这个假说，Church小组正在用高通量的方法对等位基因特异的甲基化进行研究。
相比之下，Zhang和Gao的小组主要聚焦于CpG岛上，部分原因是这些区域是高度甲基化的，且它们定义清楚，能呈现出稳定的目标组。他们比较了iPSC和人胚胎干细胞（hESC）两种染色体的所有CpG岛的甲基化模式。出乎意料的是，研究人员发现只有10%的区域在甲基化上表现出差异。对于Zhang来说，这种方法比基因组范围的测序更具优势。他认为全甲基化组测序并不经济，因为90%的数据都不能带来太多信息。
与Church小组的结果一致，Zhang和同事们发现在高度表达的基因中，启动子甲基化降低，而基因本身甲基化升高。此外，他们还发现了iPSC与hESC的甲基化模式差异。iPSC倾向于更多甲基化，这可能与再分化相关。为了更详细地评估这种差异，Zhang计划了解“干净”iPSC的甲基化状态，也就是无诱导因子、中间体以及完全分化产物的细胞。
有了这些技术，第五种碱基的作用正变得更加突出。
参考文献
Ball, M.P. et al. Targeted and genome-scale strategies reveal gene-body methylation signatures in human cells. Nat. Biotechnol. 27, 361–368 (2009).
Deng, J. et al. Targeted bisulfite sequencing reveals changes in DNA methylation associated with nuclear reprogramming. Nat. Biotechnol. 27, 353–360 (2009)
两个小组都利用了锁式探针（padlock probe）来富集基因组的选定部分。这些线性的寡核苷酸探针经过专门设计，每一端都与目标基因组的一侧杂交，DNA聚合酶随后在捕获区域延伸，经过最后的连接步骤，扩增得到环状的DNA并测序。
之前，Church和他的同事Jay Shendure已经利用锁式探针来捕获外显子；尽管这些探针是目标区域高度特异的，但它们仍表现出等位基因偏向性高和重复性差。Shendure的小组现在已经解决了这些问题，但利用重亚硫酸盐DNA的锁式探针还面临着另一个挑战：在重亚硫酸盐转化时，所有的甲基胞嘧啶转化成尿嘧啶，随后变成胸腺嘧啶，从而降低了序列的复杂度，但设计特异的探针变得更加困难。Zhang的小组与Church的小组都优化了捕获步骤，包括探针设计。
为了得到甲基化组（methylome）的整体图谱，Church及同事们将探针靶定在选定的基因组区域，而不管该区域是否富集CpG二核苷酸，并用一种甲基化敏感的酶进行消化，随后用基因组范围的切割计数来补充目标富集。在对成纤维细胞和诱导多能干细胞（iPSC）等几种细胞系进行分析后，他们发现基因表达与启动子区域的甲基化关联呈阴性，而与基因本身的甲基化呈阳性相关。Church确信这是生物学高度相关的。为了进一步证实这个假说，Church小组正在用高通量的方法对等位基因特异的甲基化进行研究。
相比之下，Zhang和Gao的小组主要聚焦于CpG岛上，部分原因是这些区域是高度甲基化的，且它们定义清楚，能呈现出稳定的目标组。他们比较了iPSC和人胚胎干细胞（hESC）两种染色体的所有CpG岛的甲基化模式。出乎意料的是，研究人员发现只有10%的区域在甲基化上表现出差异。对于Zhang来说，这种方法比基因组范围的测序更具优势。他认为全甲基化组测序并不经济，因为90%的数据都不能带来太多信息。
与Church小组的结果一致，Zhang和同事们发现在高度表达的基因中，启动子甲基化降低，而基因本身甲基化升高。此外，他们还发现了iPSC与hESC的甲基化模式差异。iPSC倾向于更多甲基化，这可能与再分化相关。为了更详细地评估这种差异，Zhang计划了解“干净”iPSC的甲基化状态，也就是无诱导因子、中间体以及完全分化产物的细胞。
有了这些技术，第五种碱基的作用正变得更加突出。
参考文献
Ball, M.P. et al. Targeted and genome-scale strategies reveal gene-body methylation signatures in human cells. Nat. Biotechnol. 27, 361–368 (2009).
Deng, J. et al. Targeted bisulfite sequencing reveals changes in DNA methylation associated with nuclear reprogramming. Nat. Biotechnol. 27, 353–360 (2009)
华大基因的MeDIP-sequencing or Bisulfite-sequencing
目前本人做了全基因的甲基化测定，但很不稳定啊
赵永东赵永东 wrote:
目前本人做了全基因的甲基化测定，但很不稳定啊
您能帮我解释一下什么是全甲基化、半甲基化、非甲基化吗？
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