【求助】如何使用抑制剂？
丁香园论坛
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我目前在研究一个信号通路中的各个蛋白的激活情况，主要是就采用western的方法检测每种蛋白的表达量，实验中没有采用抑制剂，就是设定了空白组，诱导凋亡组，药物保护组以及单独药物作用组。但是看到有的其他文章中使用了抑制剂，不知道像我这样没有使用抑制剂来研究信号通路的是不是可以呢，会不会在审稿的时候被人家提出来呢？谁有相关的研究经验，大家多交流交流！
当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或被激活，使电泳结果复杂化，影响最终结果分析。为了避免这些情况的出现，建议在样品制备时尽可能在低温下进行。此外，许多蛋白酶在pH9以上就失活了，因此Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂。因此对于我们想要研究的蛋白来说，选择性和有效的抑制这些蛋白酶对于蛋白纯化路线设计来说显得尤为重要。
蛋白酶抑制剂与蛋白酶一样，都是纷繁复杂的，通常使用许多化学物质作为蛋白酶抑制剂，如PMSF 和leupeptin。而且由于一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此通常建议复合使用蛋白酶抑制剂，如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”，见下表（来自《蛋白质电泳实验技术》）。
蛋白酶抑制剂 有效抑制的酶 PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常见的抑制剂，使用浓度为1mmol/L 不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。 AEBSF 丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低 EDTA，EGTA，使用浓度为1mmol/L 通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。 多肽蛋白酶抑制剂，使用浓度为2-20ug/ml 亮肽素（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶 TLCk，TPCK，使用浓度为0.1-0.5mmol/L 不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶 苄脒（Benzamidine）使用浓度为1-3mmol/L 抑制丝氨酸蛋白酶
但是这样配置溶液进行处理，有时也是颇为麻烦，而且效果可能并不好，目前有一些厂家试剂在简便操作，和抑制效果方面有不俗的表现，可以考虑在实验中选用，节约时间和便于结果分析。
比如，罗氏的Complete蛋白酶抑制剂混合片也许就能满足这种需要，这种试剂能抑制很多种不同的蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金属蛋白酶等，而且可应用于差不多所有的组织或细胞提物，包括来自动物、植物、酵母、细菌和直菌的样品。
除此之外，Complete蛋白酶抑制剂混合片所有成份都稳定和无毒，能提供安全和可靠的保护，这种混和片有不含EDTA的配方，这样就更不会影响依赖金属的蛋白的活性，并可确保有效进行一些纯化工作（如应用Poly-His）标记的蛋白）。
其实重要的是这种片剂操作方便：只要将一片completeTM 加进缓冲液，便可抑制多种不同的蛋白酶，有效地保护目的蛋白，效果明显，免除了称量个别抑制剂的麻烦。一举两得，何乐而不为呢？
另外针对磷酸酶，罗氏也推出了一种PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合片（可以与complete蛋白酶抑制剂兼容），这是一种即用型的片剂，其中的一些磷酸酶抑制剂只需要纳摩尔级的量。无需花费漫长的时间寻找合适的磷酸酶，也不必繁琐的称量和混合。PhosSTOP可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶，及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。
而且PhosSTOP可应用于多种细胞提取物中磷酸酶的抑制作用，包括对酸性和碱性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶的抑制作用。除了有效抑制目的蛋白的去磷酸化，PhosSTOP也不会影响后继的蛋白检测（例如：western blot）或是蛋白浓度检测 (例如：BCA或是Bradford)。
除此之外，G Biosciences的ProteCEASE™ Protease Inhibitor Cocktails包含了各种经过浓度优化后的蛋白酶抑制剂，具有良好的抑制广泛物种蛋白纯化中的蛋白酶活性的作用。ProteCEASE已经发展成为大规模制备型，具有50ml和100ml的裂解缓冲液中使用的两种规格。ProteCEASE分含有EDTA型，用于抑制金属蛋白酶（metalloprotease）；和不含有EDTA型，用于维持依赖于二价阳离子的蛋白的活性。EDTA-free ProteCEASE型不会影响使用固相亲和层析的蛋白纯化，这种方便的形式具有强烈的蛋白抑制作用。
AppliChem GmbH的AEBSF hydrochloride BioChemica通过磺酰化蛋白酶活性中心的一个基团，不可逆地抑制凝血酶thrombin和其他一些丝氨酸蛋白酶（chymotrypsin, kallikrein, plasmin, proteinase K, trypsin）。这种试剂是PMSF和DFP的低毒替代品，具有较高的水溶性，溶液状态的pH为酸性，所以在这种pH下，稳定性较高。
蛋白酶抑制剂与蛋白酶一样，都是纷繁复杂的，通常使用许多化学物质作为蛋白酶抑制剂，如PMSF 和leupeptin。而且由于一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，因此通常建议复合使用蛋白酶抑制剂，如广谱蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”，见下表（来自《蛋白质电泳实验技术》）。
蛋白酶抑制剂 有效抑制的酶 PMSF(Pheylmethylsulfonyl fluoride)是很常见的抑制剂，使用浓度为1mmol/L 不可逆抑制丝氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。 AEBSF 丝氨酸抑制剂，使用浓度为4mmol/L AEBSF的抑制活性与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低 EDTA，EGTA，使用浓度为1mmol/L 通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子来抑制金属蛋白酶。 多肽蛋白酶抑制剂，使用浓度为2-20ug/ml 亮肽素（Leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin）抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶（aprotinin）能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶 TLCk，TPCK，使用浓度为0.1-0.5mmol/L 不可逆的抑制丝氨酸和半胱氨酸的蛋白酶 苄脒（Benzamidine）使用浓度为1-3mmol/L 抑制丝氨酸蛋白酶
但是这样配置溶液进行处理，有时也是颇为麻烦，而且效果可能并不好，目前有一些厂家试剂在简便操作，和抑制效果方面有不俗的表现，可以考虑在实验中选用，节约时间和便于结果分析。
比如，罗氏的Complete蛋白酶抑制剂混合片也许就能满足这种需要，这种试剂能抑制很多种不同的蛋白酶，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及金属蛋白酶等，而且可应用于差不多所有的组织或细胞提物，包括来自动物、植物、酵母、细菌和直菌的样品。
除此之外，Complete蛋白酶抑制剂混合片所有成份都稳定和无毒，能提供安全和可靠的保护，这种混和片有不含EDTA的配方，这样就更不会影响依赖金属的蛋白的活性，并可确保有效进行一些纯化工作（如应用Poly-His）标记的蛋白）。
其实重要的是这种片剂操作方便：只要将一片completeTM 加进缓冲液，便可抑制多种不同的蛋白酶，有效地保护目的蛋白，效果明显，免除了称量个别抑制剂的麻烦。一举两得，何乐而不为呢？
另外针对磷酸酶，罗氏也推出了一种PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合片（可以与complete蛋白酶抑制剂兼容），这是一种即用型的片剂，其中的一些磷酸酶抑制剂只需要纳摩尔级的量。无需花费漫长的时间寻找合适的磷酸酶，也不必繁琐的称量和混合。PhosSTOP可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶，及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。
而且PhosSTOP可应用于多种细胞提取物中磷酸酶的抑制作用，包括对酸性和碱性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1, PP2A, PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶的抑制作用。除了有效抑制目的蛋白的去磷酸化，PhosSTOP也不会影响后继的蛋白检测（例如：western blot）或是蛋白浓度检测 (例如：BCA或是Bradford)。
除此之外，G Biosciences的ProteCEASE™ Protease Inhibitor Cocktails包含了各种经过浓度优化后的蛋白酶抑制剂，具有良好的抑制广泛物种蛋白纯化中的蛋白酶活性的作用。ProteCEASE已经发展成为大规模制备型，具有50ml和100ml的裂解缓冲液中使用的两种规格。ProteCEASE分含有EDTA型，用于抑制金属蛋白酶（metalloprotease）；和不含有EDTA型，用于维持依赖于二价阳离子的蛋白的活性。EDTA-free ProteCEASE型不会影响使用固相亲和层析的蛋白纯化，这种方便的形式具有强烈的蛋白抑制作用。
AppliChem GmbH的AEBSF hydrochloride BioChemica通过磺酰化蛋白酶活性中心的一个基团，不可逆地抑制凝血酶thrombin和其他一些丝氨酸蛋白酶（chymotrypsin, kallikrein, plasmin, proteinase K, trypsin）。这种试剂是PMSF和DFP的低毒替代品，具有较高的水溶性，溶液状态的pH为酸性，所以在这种pH下，稳定性较高。
magichunter wrote:
我目前在研究一个信号通路中的各个蛋白的激活情况
因为你在研究一个信号通路中的各个蛋白激活情况，所以没必要加入抑制剂。
如果你想说明这个信号通路参与了某个生物学过程，你要加入抑制剂。
请高手拍砖。
楼主所说的抑制剂应该是指信号通路中的蛋白激酶抑制剂~
在实验中，这类物质的主要作用是通过抑制相应的蛋白激酶活性，来研究该蛋白激酶的功能，比如想要研究PI3k在某个生理或病理活动中的作用，可以对细胞或组织用PI3K的抑制剂处理，来检测各个生理指标包括蛋白以及表征的的变化，这和楼主的实验很相似。
另外有一些蛋白酶抑制剂已经作为抗肿瘤，抗病毒药物用与临床或临床前的试验中，楼主如果需要这方面的实验的话，也是用得到的~
另外有一些蛋白酶抑制剂已经作为抗肿瘤，抗病毒药物用与临床或临床前的试验中，楼主如果需要这方面的实验的话，也是用得到的~
问题有点模糊，只能根据楼主的描述来猜测了。
楼主说设置个组，其中有空白组，诱导凋亡组，药物保护组。
想来楼主可能在研究凋亡相关的通路，类似p53, Bcl-2， caspase 或PARP之类。楼主既然说了药物保护组，说明有涉及到抑制剂之类的化合物。一般而言，凋亡研究中的药物比较多的是抑制剂。
比较加入了抑制剂kinase expression 一组和未加入抑制剂，作为对照的一组，来确定该激酶是不是和这个通路的调节相关。可能某个激酶是信号通路中的重要角色，可能只是在feedback loop里面。
另外，有的时候，还需要用siRNA.
楼主说要研究整个通路，那么相当于要做通测下整个通路的激酶表达水平，以及磷酸化的水平。
由于楼主的问题不是很清楚，无法直接回答要不要用抑制剂来研究，得看情况而定。
一楼回复的是要用蛋白酶抑制剂，感觉文不对题，蛋白酶抑制剂这个是肯定要用的，但是不需要强调,如果不用，啥蛋白都测不到了。
楼主肯定关心的是如何用抑制剂去研究signal transduction.
楼主说设置个组，其中有空白组，诱导凋亡组，药物保护组。
想来楼主可能在研究凋亡相关的通路，类似p53, Bcl-2， caspase 或PARP之类。楼主既然说了药物保护组，说明有涉及到抑制剂之类的化合物。一般而言，凋亡研究中的药物比较多的是抑制剂。
比较加入了抑制剂kinase expression 一组和未加入抑制剂，作为对照的一组，来确定该激酶是不是和这个通路的调节相关。可能某个激酶是信号通路中的重要角色，可能只是在feedback loop里面。
另外，有的时候，还需要用siRNA.
楼主说要研究整个通路，那么相当于要做通测下整个通路的激酶表达水平，以及磷酸化的水平。
由于楼主的问题不是很清楚，无法直接回答要不要用抑制剂来研究，得看情况而定。
一楼回复的是要用蛋白酶抑制剂，感觉文不对题，蛋白酶抑制剂这个是肯定要用的，但是不需要强调,如果不用，啥蛋白都测不到了。
楼主肯定关心的是如何用抑制剂去研究signal transduction.
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