形态学检查对细菌鉴定的导航作用
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形态学检查对细菌鉴定的导航作用
陈东科1孙长贵2
细菌鉴定的原则之一就是用最少的试验完成鉴定。细菌形态学检查是最基本、简单、快速的常规鉴定方法。细菌形态学包括细菌细胞形态学和细菌菌落形态学。细菌形态学正确描述依赖于方法、培养基、培养时间、染色试剂等，培养基和培养时间不同会影响细菌的形态。观察细菌的典型形态，应该是将细菌接种在该细菌最适生长的培养基上、放入该细菌最适生长环境中（包括温度和所需气体条件）进行孵育，孵育时间应视细菌的生长速度而定，大部分常见的细菌以培养24h为宜，有些细菌需要更长时间的孵育才能显现出典型的菌落特征。有时为了鉴别某一种或某一类细菌，需要观察细菌在特殊的培养基（包括显色培养基）上或在特定环境下（气体、温度和光线等）培养的形态特征[1,2,3]。
1 菌落特征观察
细菌在固体培养基表面生长形成菌落。对菌落进行描述应包括菌落大小（分大、中、小，以1mm为界）、形状、高度、边缘、表面状态、密度（透明度）、硬度（用接种环刮取菌落时的感觉）、菌落内部结构、颜色、光泽以及与培养基表面的黏附程度，还应包括菌落的溶血、气味和色素产生情况等特性。观察菌落特征的目的是为了对细菌进行初步鉴定。有些特征是某些细菌所特有的，具有属或种的鉴别价值，如肺炎链球菌在绵羊血琼脂平板上的脐窝状菌落（如图1所示）、伴放线凝集杆菌菌落特殊的内部结构（如图2所示）、侵蚀艾肯菌的斗笠样菌落、斯氏假单胞菌皱纹样菌落、变形杆菌迁徙样菌落、铜绿假单胞菌的水溶性色素、紫色色杆菌的脂溶性色素（如图3所示）、粘质沙雷菌的红色色素（如图4所示）、产吲哚金黄杆菌产生的吲哚气味、嗜血杆菌产生的鼠穴气味、诺卡菌产生的腐土气味、厌氧菌产生的腐氨气味、荧光假单胞菌产生的黄色荧光素、某些厌氧菌可产生砖红色荧光素等。有些细菌产生色素受到气体的影响（粘质沙雷菌在厌氧环境下不产色），有些细菌产生色素受到光线的影响（某些快速生长分枝杆菌是光产色或暗产色）[4]。
对细菌菌落特征的观察和描述是细菌鉴定的第一步骤，其主要目的体现在以下几方面。
1.1 病原菌定量或半定量 在对标本进行定量或半定量接种后，通过菌落计数可获得定量或半定量结果，细菌的定量在尿液分析和疗效动态观察中具有临床意义，半定量适用于开放性标本的结果分析（确定优势菌）。
1.2 确定病原菌 开放性标本受炎症组织周围皮肤、黏膜的常居菌丛污染的可能性较大，观察培养结果时应根据标本直接涂片镜检结果，结合菌落形态特征来确定病原菌。
1.3 解释血培养镜检结果 分析阳性血培养瓶的转种结果时，应结合对阳性培养液直接涂片的镜检结果，如果涂片结果与培养结果不符，应考虑操作错误或是污染所致。
1.4 确定鉴定方向 根据不同培养基上的菌落形态特征，结合革兰染色镜检结果及快速辅助试验（氧化酶、触酶、凝固酶等）结果，可确定鉴定方向。
2 菌体形态观察
革兰染色细胞形态学是细菌分类学的基础，临床微生物学实验室仍然使用细胞形态学的方法进行细菌鉴定，掌握细胞形态学的标准方法能够为准确鉴定细菌提供可靠保证。对细菌菌体形态特征的观察和描述是细菌鉴定的第二步骤，其主要目的体现在以下几方面。
2.1 解释培养结果、确定鉴定方向 无论是液体培养（如血培养、标本直接增菌培养）或是固体培养（接种琼脂平板），都应该将培养物进行涂片、染色镜检确定培养物的性质，即可快速报告，也是为下一步的鉴定指明方向。图5所示为血培养阳性培养物涂片革兰染色镜检结果。
2.2 鉴别细菌的手段 细菌菌体形态结合菌落形态特征可对细菌进行鉴别。例如，在选择性巧克力平板（加万古霉素）上生长的草绿色溶血菌落，是乳杆菌还是肠球菌（VRE）只要涂片镜检就很容易区分；鲍曼不动杆与克雷白菌属细菌的菌落形态相似，区别在于前者为革兰阴性球杆菌（接近球菌），后者为革兰阴性杆菌；丹毒丝菌在血平板上的菌落形态与草绿色链球菌很相像，但镜下形态差别很大。图6所示为红斑丹毒丝菌的革兰染色镜下形态[4]。
2.3 鉴定方向及试剂选择的依据 葡萄球菌和链球菌、革兰阳性球菌和革兰阳性杆菌、革兰阴性球菌和革兰阴性杆菌的鉴定方向均不同，鉴定试剂选择也不同。
2.4 药敏组合选择的依据 CLSI文件规定，每一种细菌都有一定的抗菌药物组合供选择。要准确进行药敏组合选择，就必须有准确的细胞形态学结果作支持。
3 菌体特殊结构的观察[4]
3.1 荚膜 荚膜是某些细菌在细胞壁外包裹的一层粘液性物质，不同的细菌其荚膜成分也有一定差异，一般由多糖、多肽或蛋白质组成。荚膜作为细菌的毒力因子有必要对其染色观察，但荚膜染色对于临床标本分离菌株的鉴定价值并不大。图7所示为大肠埃希菌荚膜染色结果。
3.2 鞭毛 观察细菌鞭毛对于细菌鉴定具有重要的价值。依据鞭毛位置和数量，细菌分为单端极鞭毛菌、单端双鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。鞭毛是细菌的动力器官，大多数情况下可用动力试验验证细菌鞭毛的存在，但动力试验无法代替鞭毛染色在细菌鉴定中的地位。图8所示为霍乱弧菌鞭毛染色结果。
3.3 芽胞 芽胞的形态包括芽胞形状、芽胞位置和孢子囊膨大。芽胞形态分为圆柱形、椭圆形、球形，芽胞位置分为端生、近端生、中生或近中生。根据芽胞的形态学可以进行芽胞杆菌属和梭菌属的鉴定。芽胞染色并不优于革兰染色，使用相差显微镜观察芽胞优于芽胞染色和革兰染色。图9所示为艰难梭菌芽胞染色结果。
3.4 异染颗粒 其主要成分是多聚偏磷酸盐，可随菌龄的延长而变大。多聚磷酸盐颗粒对某些染料有特殊反应，产生与所用染料不同的颜色，因而得名异染颗粒。如用甲苯胺蓝、次甲基蓝染色后不呈蓝色而呈紫红色。棒状杆菌和某些芽胞杆菌常含有这种异染颗粒。白喉棒状杆菌异染颗粒位于菌体两端，故又称极体，有助于该菌的鉴定。图10所示为白喉棒状杆菌异染颗粒染色结果。
综上所述, 临床微生物学实验室常规鉴定细菌离不开形态学检查,很难想象革兰染色和形态学检查错误会得到正确的鉴定结果，形态学检查对鉴定细菌起着“导航”作用，具有重要的价值，临床微生物学检验工作者应予重视。
参考文献
[1] Murray PR. Manual of clinical microbiology[M]. 10th ed. Washington DC: American Society for Microbiology Press, 2011.
[2]蔡文诚,蔡岳廷. 实用临床微生物诊断学[M]. 第10版, 台北：九州图书文物有限公司出版,2011.
[3]谷海瀛.形态学检查方法的标准化及其在细菌鉴定中的作用.中华检验医学杂志2006，29（10）：951-953.
[4]陈东科,孙长贵.实用临床微生物学检验与图谱[M]. 第1版, 北京：人民卫生出版社, 2011.
