【求助】基因合成问题
丁香园论坛
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各位师兄师姐好:
我所做的基因的mRNA的长度为5371bp,能否让公司合成引物,然后再通过PCR得到基因全长。这样能否实现?如果不能,怎样才能得到基因序列?请各位高手指教。谢谢!
我所做的基因的mRNA的长度为5371bp,能否让公司合成引物,然后再通过PCR得到基因全长。这样能否实现?如果不能,怎样才能得到基因序列?请各位高手指教。谢谢!
长的mRNA的确无论从RNA提取的完整性、反转录上来说都是不小的难度。
建议你分段扩增,然后用“桥接”法扩增出完整的cDNA。现在有的公司推出有长程扩增的PCR试剂,但是我没有用过,不知道扩增数千bp的片段效果怎么样。如果用桥接法扩增几个注意事项和策略如下:
1。RNA提取的质量尽量要好;
2,多合成几对引物,如果你按照1000bp左右的片段扩增可能会好一些,有人说上了2000bp的片段扩增就不好扩增了,这个我不确定,但是片段越长,完整的mRNA存在的纪律可能就小些。
这些引物的要求,1),最好引物之间的Tm值相差不大,每一对上下游引物都可以用来扩增片段;2)扩增的片段之间有相互重叠的部分,这个重叠部分有一两百bp应该就可以了。比如你有六个片段,ABCDEF。可以先分别扩增A B C D E F,然后把A和B混合,在反映体系中加入Taq酶,dNTP等,然后加入A的上游引物和B的下游引物,进行扩增,这样就得到一个较长片段AB,依此扩增出CD、EF,然后把几个片段融合。你也可以先把AB融合片段和C、D、E、F依次融合。
建议你分段扩增,然后用“桥接”法扩增出完整的cDNA。现在有的公司推出有长程扩增的PCR试剂,但是我没有用过,不知道扩增数千bp的片段效果怎么样。如果用桥接法扩增几个注意事项和策略如下:
1。RNA提取的质量尽量要好;
2,多合成几对引物,如果你按照1000bp左右的片段扩增可能会好一些,有人说上了2000bp的片段扩增就不好扩增了,这个我不确定,但是片段越长,完整的mRNA存在的纪律可能就小些。
这些引物的要求,1),最好引物之间的Tm值相差不大,每一对上下游引物都可以用来扩增片段;2)扩增的片段之间有相互重叠的部分,这个重叠部分有一两百bp应该就可以了。比如你有六个片段,ABCDEF。可以先分别扩增A B C D E F,然后把A和B混合,在反映体系中加入Taq酶,dNTP等,然后加入A的上游引物和B的下游引物,进行扩增,这样就得到一个较长片段AB,依此扩增出CD、EF,然后把几个片段融合。你也可以先把AB融合片段和C、D、E、F依次融合。
多谢楼上的建议,但我的mRNA也不能通过提取的方法得到,因为他一般情况下不表达的!
liusurong00 wrote:
多谢楼上的建议,但我的mRNA也不能通过提取的方法得到,因为他一般情况下不表达的!
我的基因是cyld,是一种肿瘤抑制因子,上一个写错了 , mRNA在一般情况下不表达。正因为一般不表达, mRNA所以不能提取得到,其基因的cDNA全长只能通过公司合成引物,在PCR!不知道我这样说准确吗?
迷惑,cDNA一般是由mRNA转录而来;我觉得你应该想合成全基因,目前有些公司可以提供全基因合成服务,也就是你所说的合成引物吧,否则,你模板哪里来?
现在弄明白了,我从细胞中提取mRNA(购买试剂盒),然后在通过RT得到cDNA,然后PCR得到基因的 扩增。谢谢楼上的 回答
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