【求助】基因串联的方法有哪些？
丁香园论坛
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不知道哪位大侠有比较成熟的基因串联的方法，或者相关的比较牛的实验室的参考文献。希望不吝赐教。
ding
我试过利用T载体的制造方法把基因串联起来...
具体就是先把载体改造一下,插入一个EcoRV位点,切之然后加T制成T载体,然后把基因P出来(引物设计的时候加上一个EcoRV位点),按T克隆的做法把基因克隆进去(在载体上另设一对引物用于克隆筛选).因为引物上带了EcoRV位点,又可以进一步做成T载体,再把基因克进去,如此反复...
关键是T载体要制备的好，筛选的时候多挑几个克隆,如果需要定向克隆基因的话可利用载体上的引物筛选之,然后利用基因内部合适的酶切位点来验证...
欢迎交流!
具体就是先把载体改造一下,插入一个EcoRV位点,切之然后加T制成T载体,然后把基因P出来(引物设计的时候加上一个EcoRV位点),按T克隆的做法把基因克隆进去(在载体上另设一对引物用于克隆筛选).因为引物上带了EcoRV位点,又可以进一步做成T载体,再把基因克进去,如此反复...
关键是T载体要制备的好，筛选的时候多挑几个克隆,如果需要定向克隆基因的话可利用载体上的引物筛选之,然后利用基因内部合适的酶切位点来验证...
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我做过三段重复片段的串联,用的是pBV220载体.
第一对引物为EcoRI_KpnI_____BamHI;第一段单体插入pBV220载体中的EcoRI和BamHI位点之间;
第二对引物为EcoRI_NdeI_____KpnI;第二段单体插入第一段单体中EcoRI和KpnI位点之间;
第三对引物为EcoRI_____NdeI;第三段插入第二段单体中EcoRI和NdeI位点之间;由此可将三段单体连接起来.
作出来的效果很好.
另附上一篇文献,或许你可以从中学点东西.
第一对引物为EcoRI_KpnI_____BamHI;第一段单体插入pBV220载体中的EcoRI和BamHI位点之间;
第二对引物为EcoRI_NdeI_____KpnI;第二段单体插入第一段单体中EcoRI和KpnI位点之间;
第三对引物为EcoRI_____NdeI;第三段插入第二段单体中EcoRI和NdeI位点之间;由此可将三段单体连接起来.
作出来的效果很好.
另附上一篇文献,或许你可以从中学点东西.
bentz wrote:
我试过利用T载体的制造方法把基因串联起来...
具体就是先把载体改造一下,插入一个EcoRV位点,切之然后加T制成T载体,然后把基因P出来(引物设计的时候加上一个EcoRV位点),按T克隆的做法把基因克隆进去(在载体上另设一对引物用于克隆筛选).因为引物上带了EcoRV位点,又可以进一步做成T载体,再把基因克进去,如此反复...
关键是T载体要制备的好，筛选的时候多挑几个克隆,如果需要定向克隆基因的话可利用载体上的引物筛选之,然后利用基因内部合适的酶切位点来验证...
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好方法，谢谢分享！
谢谢大家的帮助！
很是感激！
很是感激！
那关于核糖体结合位点以及启动子就不需要考虑吗？
p.s这个问题是不是很傻那？
希望大家多多给予回复！谢谢
p.s这个问题是不是很傻那？
希望大家多多给予回复！谢谢
还有，做这个需要考虑真核原核地问题吗？
该怎么解决！谢谢
该怎么解决！谢谢
是不是指IRES啊？
bentz wrote:
我试过利用T载体的制造方法把基因串联起来...
具体就是先把载体改造一下,插入一个EcoRV位点,切之然后加T制成T载体,然后把基因P出来(引物设计的时候加上一个EcoRV位点),按T克隆的做法把基因克隆进去(在载体上另设一对引物用于克隆筛选).因为引物上带了EcoRV位点,又可以进一步做成T载体,再把基因克进去,如此反复...
关键是T载体要制备的好，筛选的时候多挑几个克隆,如果需要定向克隆基因的话可利用载体上的引物筛选之,然后利用基因内部合适的酶切位点来验证...
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如果载体改造成了T载体,P 的基因产物加A直接进行T-A连接克隆就可.为什么引物设计还要加EcoRV的位点?
摸索中~~
bentz wrote:
我试过利用T载体的制造方法把基因串联起来...
具体就是先把载体改造一下,插入一个EcoRV位点,切之然后加T制成T载体,然后把基因P出来(引物设计的时候加上一个EcoRV位点),按T克隆的做法把基因克隆进去(在载体上另设一对引物用于克隆筛选).因为引物上带了EcoRV位点,又可以进一步做成T载体,再把基因克进去,如此反复...
关键是T载体要制备的好，筛选的时候多挑几个克隆,如果需要定向克隆基因的话可利用载体上的引物筛选之,然后利用基因内部合适的酶切位点来验证...
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如果载体改造成了T载体,P 的基因产物加A直接进行T-A连接克隆就可.为什么引物设计还要加EcoRV的位点?
因为要反复的利用EcoR V的酶切位点来加T，这样才可以继续加第二个基因。
我试过利用T载体的制造方法把基因串联起来...
具体就是先把载体改造一下,插入一个EcoRV位点,切之然后加T制成T载体,然后把基因P出来(引物设计的时候加上一个EcoRV位点),按T克隆的做法把基因克隆进去(在载体上另设一对引物用于克隆筛选).因为引物上带了EcoRV位点,又可以进一步做成T载体,再把基因克进去,如此反复...
关键是T载体要制备的好，筛选的时候多挑几个克隆,如果需要定向克隆基因的话可利用载体上的引物筛选之,然后利用基因内部合适的酶切位点来验证...
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如果载体改造成了T载体,P 的基因产物加A直接进行T-A连接克隆就可.为什么引物设计还要加EcoRV的位点?
因为要反复的利用EcoR V的酶切位点来加T，这样才可以继续加第二个基因。
是的 对于IRES,我也有点不是很明白，这个应该是真核里有的吧，
大家在此说的基因串联是指的相同的一段DNA序列首尾相连成几个拷贝的现象。在讨论时考虑到在宿主菌中发生的重组问题没有？
就是说在体外(如试管中的片段与载体的)连接是很容易发生多拷贝串联的，但转化到菌(如常用的DH5a)中之后会因重组而成为单拷贝的趋向。这段相同的序列越长发生重组的机会就越多，也就是越不容易拿到多拷贝。我的体会是构建较短片段的多串联并不难，如7个Myc。但构建较长片段的多串联就很难了，而且在扩增的过程中保持它的多串联状态也应引起足够的重视。这也是为什么有被重组嫌疑的质粒(如某些慢病毒载体质粒)要强调用去重组功能的菌株Stbl3来扩增的原因。
就是说在体外(如试管中的片段与载体的)连接是很容易发生多拷贝串联的，但转化到菌(如常用的DH5a)中之后会因重组而成为单拷贝的趋向。这段相同的序列越长发生重组的机会就越多，也就是越不容易拿到多拷贝。我的体会是构建较短片段的多串联并不难，如7个Myc。但构建较长片段的多串联就很难了，而且在扩增的过程中保持它的多串联状态也应引起足够的重视。这也是为什么有被重组嫌疑的质粒(如某些慢病毒载体质粒)要强调用去重组功能的菌株Stbl3来扩增的原因。
呵呵 最近在坐车从南到北，没关注，希望还是有能人能继续关注，我觉得这个很重要，我是想串联不同的基因，不是同一个。
应该在不同的基因序列前面加上启动子和部分调控序列？
如果是载体本身是强启动子 应该就不用每个都加了吧？
如果是载体本身是强启动子 应该就不用每个都加了吧？
学习中，谢谢
你好，这种方法的表达量高吗？不用linker 吗？现在我也要做三个片段的串联，打算用linker连接，如果两边linker不一样，可以吗？
学习了~~
还有同源重组
PNAS上有这样的文章
国内有这样的文章
可以查阅下
PNAS上有这样的文章
国内有这样的文章
可以查阅下
我们实验室是用同尾酶连接失活的方法来做重复串联的
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