基因枪活体植物基因转染
威泰克
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引言
本实验所用基因传递系统（基因枪）原理： 低压基因递送系统（GDS-80 基因枪 U.S. Patent Number: 6,436,709 B1），根据火箭喷嘴原理和空气动力学原理设计，是用于传递生物微粒进入靶细胞的一种新型系统。如图 1 中所示，当左侧出现输入气体压力时（如：氦气），两个腔室之间将形成巨大的压力差，一旦该气体穿过装载样品的咽喉处，GDS-80 中的气体输出将为生物粒子提供足够的动能量，使它们加速到接近超音速的速度（约 300m/s）。在加速过程中，样品溶液会雾化并均匀地喷洒到靶向目标的表面上。
图 1. GDS-80 输送系统的设计原理
影响转染效率的因素
在执行 GDS-80 轰击的同时，有四个主要因素影响转染效率。涉及火箭喷嘴设计原理方面，有两个：传递压力的设定和枪管的直径。通过增加输送压力的设定，可以使两个腔室中的压力差变大，从而增加生物微粒的速度，增加动能；而增大枪管直径会降低微粒的输出速度。传递距离也在实验中起到重要的作用，通过增加从枪管到目标样品的传递距离，生物颗粒将受空气阻力影响而减慢速度，不过这样也同时降低了损坏靶细胞的几率。最后一个因素是传送样品的总量，被传送的样品量越大，越够能提高转染效率。 然而，调整输送距离和传递压力是几个因素中最重要的，枪管大小和输送样品量应该保持在一个恒定数值，这样更容易修正实验。
活体植物实验
针对植物细胞的基因组研究，现在已经通过使用很多不同的策略而被广泛开展。无论这些研究的主要目的是什么，这些研究成果终究是需要应用于活体植物的研究中来。将基因转染到活体植物方面之前存在很多障碍，比如如何维持无微生物的环境，如何保护植物本身组织的脆弱性，如何设定传递压力的大小，甚至是植物处于什么生长状况都是需要考虑的方面。通过使用 GDS-80 系统，Wealtec 公司为基因转染活体植物这项实验提供了最便捷的方法。
通过调节传递压力和距离，GDS-80 可将生物微粒成功转染到活体植物的植物细胞中。
材料:
烟草叶和藜属植物
低压基因递送系统：GDS-80（Wealtec）
通用目标间隔器，UTS-10（Wealtec）
质粒 DNA：以绿色荧光蛋白（GFP）报告性基因构建的病毒 DNA。
MaestroTM 活体成像系统。（CRI 公司）
操作步骤：
1. 在进行实验前，至少培养样品 30 天，这样确能保叶片大于 5×6 cm2。
2. 根据以下步骤制备 DNA-金粉混合液：
a. 将金粉微粒中加入充足的无菌蒸馏水。
b. 使用 100％ 乙醇对金粉微粒进行三次洗涤并弃去浮层。
c. 加蒸馏水使金粉微粒重新悬浮。
d. 将准备好的 DNA 溶液（1 μg/μl）添加到金粉微粒溶液中，形成浓度为 1 μg DNA / 0.6 mg 金粉微粒悬浊液。
e. 剧烈摇晃微离心管使得样品混合均匀。
f. 滴入适当体积的 0.1M 亚精胺和 2.5M CaCl2 进入试管，同时不断剧烈地摇晃。
g. 继续摇晃一分钟以上。
h. 用 100％EtOH 进行三次洗涤，并弃去浮层。
i. 重新使 DNA 包裹的金粒子悬浮于 100% 的 EtOH 中。
3. 按照说明书中要求的，讲 UTS-10 安装到 GDS-80 系统上，并设置 40-50 psi 的传递压力。
4. 调整距离量尺至 6-8 cm 的传递距离。
5. 把四爪叶片夹夹到目标叶上，用手调螺栓将其拧紧固定。
6. 将等分 10μl DNA 混匀悬浊液倒入样品装载孔中。
7. 对叶片标本进行轰击。
8. 培育植株三天以上，通过使用 CRi MaestroTM 的体内成像系统观察荧光结果。
讨论
图 2. 叶子被轰击后培育 3 天。通过使用 CRi Maestro TM 活体成像系统，左侧照片使用真彩色图像拍摄，右侧照片使用荧光感光拍摄。
图3. 经过7天培育后，与被轰击过的叶子同属一颗烟草植株上的另一片叶子。通过使用CRi Maestro TM活体成像系统，左侧照片使用真彩色图像拍摄，右侧照片使用荧光感光拍摄。
讨论
活体植物的性状特征和组织构成在不同植物间是有区别的。而在轰击活体植物过程中，有很多关于该特定种类植株的情况需要被考虑到，如植物所处生长阶段、植物大小、组织损伤，以及轰击部位。当传递生物微粒进入植物细胞时，操作者需要基于植物组织的性状而调节传递条件。在这篇文章中，藜叶的结构比烟草叶结构更复杂。当向藜叶传递时，最好要缩短 1-2 cm 的传递距离或增加传递压力，以获得更好的结果。图 2 中，藜叶使用距离 6 cm/50 psi 传递，烟草叶通过 UTS-10 配件辅助使用距离 8 cm/40 psi 传递。 然而，在缩短与藜叶距离后，烟草叶子上的转染效率依然比较高。无论什么时候，组织都不应在轰击后而受到损伤导致枯萎，这是调节传递条件时应首先遵循的原则。
经过 7 天的培养，由于 DNA 质粒中构建了具有 GFP 报告性基因的病毒 DNA，因此 GFP 基因能够遍及整个植株表达和扩展。在图中 3 中可以看到，被轰击植株上的不同叶子，通过毛细管束被 GFP 基因感染。如果培养的时间周期较长，该基因可在整个植株中传递。
通过调节压力和距离这两方面来控制传递条件是非常容易实现的。 GDS-80 是一款非常强大的工具，尤其用来传递基因到活体植物中。通过 UTS-10 配件的辅助，无论是在体内还是在体外进行的实验，用户都可以更轻松地完成他们的植物靶向实验。
