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基因枪活体植物基因转染

威泰克

6116

引言

本实验所用基因传递系统(基因枪)原理:

低压基因递送系统(GDS-80 基因枪 U.S. Patent Number: 6,436,709 B1),根据火箭喷嘴原理和空气动力学原理设计,是用于传递生物微粒进入靶细胞的一种新型系统。如图1中所示,当左侧出现输入气体压力时(如:氦气),两个腔室之间将形成巨大的压力差,一旦该气体穿过装载样品的咽喉处,GDS-80 中的气体输出将为生物粒子提供足够的动能量,使它们加速到接近超音速的速度(约 300m/s)。在加速过程中,样品溶液会雾化并均匀地喷洒到靶向目标的表面上。


影响转染效率的因素:

在执行 GDS-80 轰击的同时,有四个主要因素影响转染效率。涉及火箭喷嘴设计原理方面,有两个:传递压力的设定和枪管的直径。通过增加输送压力的设定,可以使两个腔室中的压力差变大,从而增加生物微粒的速度,增加动能;而增大枪管直径会降低微粒的输出速度。传递距离也在实验中起到重要的作用,通过增加从枪管到目标样品的传递距离,生物颗粒将受空气阻力影响而减慢速度,不过这样也同时降低了损坏靶细胞的几率。最后一个因素是传送样品的总量,被传送的样品量越大,越够能提高转染效率。 然而,调整输送距离和传递压力是几个因素中最重要的,枪管大小和输送样品量应该保持在一个恒定数值,这样更容易修正实验。

活体植物实验:

针对植物细胞的基因组研究,现在已经通过使用很多不同的策略而被广泛开展。无论这些研究的主要目的是什么,这些研究成果终究是需要应用于活体植物的研究中来。将基因转染到活体植物方面之前存在很多障碍,比如如何维持无微生物的环境,如何保护植物本身组织的脆弱性,如何设定传递压力的大小,甚至是植物处于什么生长状况都是需要考虑的方面。通过使用 GDS-80 系统,Wealtec 公司为基因转染活体植物这项实验提供了最便捷的方法。

通过调节传递压力和距离,GDS-80 可将生物微粒成功转染到活体植物的植物细胞中。

材料:

  • 烟草叶和藜属植物
  • 低压基因递送系统:GDS-80 (Wealtec)
  • 通用目标间隔器,UTS-10 (Wealtec)
  • 质粒 DNA:以绿色荧光蛋白(GFP)报告性基因构建的病毒 DNA。
  • MaestroTM 活体成像系统。 (CRI 公司)

操作步骤:

1. 在进行实验前,至少培养样品 30 天,这样确能保叶片大于 5×6 cm2。

2. 根据以下步骤制备 DNA-金粉混合液:
a. 将金粉微粒中加入充足的无菌蒸馏水。
b. 使用 100% 乙醇对金粉微粒进行三次洗涤并弃去浮层。
c. 加蒸馏水使金粉微粒重新悬浮。
d. 将准备好的 DNA 溶液(1μg/μl)添加到金粉微粒溶液中,形成浓度为 1 μg DNA / 0.6 mg 金粉微粒悬浊液。
e. 剧烈摇晃微离心管使得样品混合均匀。
f. 滴入适当体积的 0.1M 亚精胺和 2.5M CaCl2 进入试管,同时不断剧烈地摇晃。
g. 继续摇晃一分钟以上。
h. 用 100%EtOH 进行三次洗涤,并弃去浮层。
i. 重新使DNA包裹的金粒子悬浮于100% 的 EtOH 中。

3. 按照说明书中要求的,讲 UTS-10 安装到 GDS-80 系统上,并设置 40-50 psi 的传递压力。

4. 调整距离量尺至 6-8 cm 的传递距离。

5. 把四爪叶片夹夹到目标叶上,用手调螺栓将其拧紧固定。

6. 将等分10μl DNA混匀悬浊液倒入样品装载孔中。

7. 对叶片标本进行轰击。

8. 培育植株三天以上,通过使用 CRi MaestroTM 的体内成像系统观察荧光结果。


(A)烟草植物叶片


(B)藜属植物叶片

图 1. 叶子被轰击后培育 3 天。通过使用 CRi Maestro TM 活体成像系统,左侧照片使用真彩色图像拍摄,右侧照片使用荧光感光拍摄。



(C)烟草植物叶片

图2. 经过 7 天培育后,与被轰击过的叶子同属一颗烟草植株上的另一片叶子。通过使用 CRi Maestro TM 活体成像系统,左侧照片使用真彩色图像拍摄,右侧照片使用荧光感光拍摄。

讨论:

活体植物的性状特征和组织构成在不同植物间是有区别的。而在轰击活体植物过程中,有很多关于该特定种类植株的情况需要被考虑到,如植物所处生长阶段、植物大小、组织损伤,以及轰击部位。当传递生物微粒进入植物细胞时,操作者需要基于植物组织的性状而调节传递条件。在这篇文章中,藜叶的结构比烟草叶结构更复杂。当向藜叶传递时,最好要缩短 1-2cm 的传递距离或增加传递压力,以获得更好的结果。图2中,藜叶使用距离 6 cm/50 psi 传递,烟草叶通过 UTS-10 配件辅助使用距离 8cm/40 psi 传递。 然而,在缩短与藜叶距离后,烟草叶子上的转染效率依然比较高。无论什么时候,组织都不应在轰击后而受到损伤导致枯萎,这是调节传递条件时应首先遵循的原则。

经过 7 天的培养,由于 DNA 质粒中构建了具有GFP报告性基因的病毒 DNA,因此 GFP 基因能够遍及整个植株表达和扩展。在图中 3 中可以看到,被轰击植株上的不同叶子,通过毛细管束被 GFP 基因感染。如果培养的时间周期较长,该基因可在整个植株中传递。

通过调节压力和距离这两方面来控制传递条件是非常容易实现的。 GDS-80 是一款非常强大的工具,尤其用来传递基因到活体植物中。通过 UTS-10 配件的辅助,无论是在体内还是在体外进行的实验,用户都可以更轻松地完成他们的植物靶向实验。

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