基因枪室外大田田间棉花活体植物转染耐盐性研究
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背景
目前盐碱地面积日益扩大，改良和培育耐盐碱的作物，有效开发利用盐碱地已成为世界性研究课题。棉花是典型的耐盐碱的先锋作物，但是目前生产上推广的耐盐棉花品种仍比较缺乏，挖掘耐盐基因，通过转基因技术改良棉花的耐盐能力，培育棉花耐盐品种显得尤为重要。棉花是公认的比较耐盐的作物，是盐碱地的先锋作物，它的耐盐性相对于粮食作物稍强。但高盐环境对棉花的产量影响仍不可忽视，并且棉属种间的耐盐性、品种和材料之间的耐盐性以及不同生长发育阶段的耐盐性等都有很大差异。目前，我国东北、西北及滨海地区的盐碱荒地和有盐碱障碍的耕地总面积已经超过3.33×107hm2，其中具有农业利用潜力的近 1.33×107hm2，占我国耕地总面积 10%以上；随着盐碱地的不断扩大，据不完全调查统计，2011 年新疆灌区耕地面积已达 3.99×106hm2（不包括旱地），其中盐碱化面积为 1.28×106hm2，占灌区耕地面积的 32.07%，适宜耕地面积的不断减少将直接影响各类作物的产量，直接造成巨大的国民经济损失。
因此，开发利用盐碱地具有很大的潜在经济价值和重要的社会意义。目前认为在盐碱地种植耐盐作物，是开发利用盐碱地的重要途径之一，而棉花作为盐碱地的先锋和重要的经济作物之一，毫无置疑做出了巨大的贡献，其中通过基因工程和转基因技术向棉花导入外源目的基因已成为改良和培育耐盐棉花新品种的新途径。
本研究的目的是利用典型的耐盐藻类作为实验材料，克隆海带的碳酸酐酶基因和杜氏盐藻的甘油醛-3-磷酸脱氢酶 2 个耐盐相关基因转入棉花，计划将其两种基因转入棉花，期望获得耐盐性较强转基因棉花，为基因工程技术培育棉花耐盐的新品种奠定基础。
本研究的实验技术路线如图 1-1：
2.5.7棉花花粉绿色荧光检测方法：
（一）棉花花粉自发绿色荧光检测
选取本课题组 26 种棉花材料，检测花粉是否有自发绿色荧光现象，具体步骤如下：
（1）收集所选材料的花粉于 1.5ml 离心管中。
（2）滴一滴 ddH2O（尽量滴少点，因为花粉太小，遇水易胀破流出内含物不利于观察）于洁净的载玻片上，然后用小镊子盖上洁净的盖玻片，防止进入空气产生气泡。
（3）把制作好的玻片倒放在激光共聚焦显微镜 FV1000 的载物台上，在 488nm 波长下观察花粉自发绿色荧光的现象和强度。
（二）基因枪活体转化 CA 基因至棉花花粉的绿色荧光检测选取以上检测到的花粉自发绿色荧光弱的材料，用基因枪将带有 pBI121-CA::GFP的质粒活体转化至棉花花粉，再次观察绿色荧光现象和强度，步骤如下：
（1）载体质粒的提取：将带有 pBI121- CA::GFP 质粒的大肠杆菌接种到含有卡那抗生素的 LB 液体培养基中，37℃，175rpm 过夜培养，根据 OMEGA 质粒大提试剂盒操作步骤进行质粒提取，并琼脂糖电泳检测条带，测浓度备用。
（2）金粉处理（60mg/ml）：首先取 30mg 金粉置于 1.5ml 离心管中，加 1ml70%乙醇，充分震荡 3-5min，静置 15min；12000rpm 离心 30s，然后去上清；加 1ml 无菌水重悬；12000rpm 离心 15s，然后去上清；酒精和灭菌 ddH2O 重复上述步骤洗涤 5-7 次；将金粉悬浮于 500μl 灭菌 ddH2O 中，于 4℃或者室温下保存。
（3）质粒的处理：取 100μl 金粉悬浮液，将含有 CA 基因的质粒 10μl（1mg/ml）溶液加到金粉悬浮液中；事先配好 0.1M 亚精胺、2.5MCaCl2以及冰浴无水乙醇；逐滴加入 40μl0.1M 亚精胺并混匀；逐滴加入 100μl2.5MCaCl2，震荡 1min；12000rpm 离心 30s，去上清；加入 200μl 无水乙醇重悬金粉，震荡 30s；12000rpm 离心 30s，去上清；然后加入 100μl 无水乙醇悬浮金粉，可供 10 枪（每枪 10μl）使用，放入-20℃备用。
（4）基因枪 GDS-80 轰击时氦气罐的气压为 1350psi，取 10μl DNA 包裹好的微粒悬浮液加到基因枪中央，进行轰击事先收集好的花粉，之后放置在 25℃避光过夜。
（5）使用激光共聚焦显微镜 FV1000 在 488nm 波长下，观察转化基因后花粉绿色荧光现象和强度。
2.5.8 基因枪活体转化棉花
用便携式基因枪 GDS-80 在大田活体转化棉花，其具体步骤如下：
（一）载体质粒的提取：提取 pBI121-CA/GAPDH 质粒，方法见 2.5.7 所述。
（二）金粉处理：方法见 2.5.7 所述。
（三）质粒的处理：方法见 2.5.7 所述。
（四）大田转化：
（1）选择确定好大田里要进行转化的棉花材料和行数，转化时间定在棉花的盛花期 7 月中旬到 8 月中旬，本研究选择的转化受体材料为：非抗虫棉材料沪 749513、F12（A 系）和 F12（B 系）；抗虫棉材料 GK50 和豫 2067。
（2）在转化的第一天下午采集花朵（天气和花的开放情况不同，采集的花朵个数不定），然后室温放置实验台上（最好每朵花都放开些，以免影响花粉活力，每个材料的花朵要做好标记），而已经去掉雄蕊的花一定用蜡管套住柱头。
（3）第二天早上 9:00-10:00 左右开始收集花粉，收集好的花粉放于干净的培养皿内，并做好标记。
（4）取 10μl 金粉和质粒的悬浮液加入到基因枪 GDS-80 孔内，用手轻轻拍打枪的加样孔附近两下，使其所加的样品完全进入枪内，轰击采集的新鲜花粉（根据花粉的多少确定轰击的次 数，一般 1-2 次），轰击后的花粉靠人工涂抹于雄蕊的柱头（注意用花的柱头涂抹，不要直接用手涂抹，手上有水分容易使花粉活力减弱，涂抹后的花朵容易脱落，成铃率低），11:00 左右即花粉活力比较强的时间段进行涂抹，最后用蜡管重新套在涂抹花粉后的柱头上，以免发生杂交，挂牌做好标记。
（5）待种子成熟，将收获的种子做好标记（转化的棉花材料和转基因名字），晒干后脱绒保存。下图 2-3 是实验中基因枪大田转化的流程图片：
基因枪法活体转化分析
目前遗传转化体系已相当完善，农杆菌介导法、电穿孔法、显微注射法、基因枪法、聚乙二醇（PEG）法、花粉管通道法、脂质体介导法等方法均在遗传转化中应用并获得转基因植株，但目前用的最多的方法是基因枪法、电穿孔法和农杆菌介导法。
基因枪的优点是无宿主限制，靶受体类型广，不受组织的类型限制，基本上所有具有细胞或有潜在分生能力的组织都可以用基因枪进行轰击转化；可控度高；操作简便、快速，电击法、聚乙二醇转化法等需要进行大量的繁琐工作，农杆菌介导法需要进行农杆菌感受态细胞的制备、共培养、抑菌等诸多操作步骤，而基因枪法是一种物理过程。缺点是基因枪轰击的随机性很大，外源基因进入宿主基因组的整合位点不固定，可以在一条染色体或不同染色体上进行多位点整合；有序性和计量性差，整合机制不是很清楚，拷贝数较多，导致转基因后代外源基因容易丢失、突变、结构变化、环化甲基化、引起基因沉默等现象发生，遗传效应较复杂，基因间的位置效应，共抑制现象等表现比较明显。不利于外源基因在宿主内的稳定表达，并且基因枪价格昂贵、运转费用较其他方法高。
本实验利用基因枪法，但不是采用传统的台式基因枪，而是利用便携式 GDS-80 基因枪，由于其装备价格昂贵目前还没有得到普及使用，台式基因枪法一般轰击幼胚、叶圆片或者愈伤组织等，以获得转基因植株，整个装备比较笨重和需要固定，因此实验操作地点比较受限制，而利用便携式 GDS-80 基因枪可以直接在棉花大田活体转化棉花花粉，易操作，污染少，缩短了时间，成活率相对提高，为开辟转基因新途径打下基础。
实验中影响基因枪转化能否成功的关键因素也很多。涉及到受体植物的基因型，比如棉花的二倍体和四倍体材料；选择的受体材料的转化部位；外部环境影响，比如天气会影响花粉活力；轰击后的花粉选择涂抹的方式；基因枪的轰击参数，一般包括微弹的类型、速度和射程轰击压力、氦气钢压、轰击的次数、质粒 DNA 的纯度与浓度、轰击材料与基因枪之间的射程距离等因素，对于不同受体植株都有不同的要求。
本研究的总体结论
本实验通过对 NCBI 核酸数据库分析筛选，克隆了海带 CA 和杜氏盐藻 GAPDH 两个耐盐相关基因，并对其基因进行生物信息学分析，载体构建及基因表达分析、活体转基因、转基因种子耐盐性验证及分子检测等研究，得出以下结论：
（1）克隆了两个藻类基因完整 ORF：海带 CA 和杜氏盐藻 GAPDH 基因，并分析了基因结构。
（2）完成了亚细胞定位：CA 基因编码蛋白定位于细胞核膜上，GAPDH 基因编码蛋白定位于细胞膜上。
（3）完成了瞬时表达分析：检测了 26 种棉花材料的花粉自发绿色荧光现象，并利用基因枪转化 CA 基因至 3 种自发绿色荧光弱的花粉进行瞬时表达，结果表明3 种棉花材料的花粉绿色荧光现象均明显增强。
（4）基因枪转化棉花并完成了转基因植株的检测：T0代部分种子经过耐盐性检测、PCR 扩增和测序，检测到阳性植株且耐盐性提高。
本研究的创新点
（1）在海带和杜氏盐藻中克隆得到两个耐盐基因，并利用第三代便携式 GDS-80基因枪活体转化方法转入棉花。
（2）在棉花上验证了藻类基因的耐盐性，并结合系统的分子检测，提高了基因检测效率和准确性。
（3）亚细胞定位及在棉花花粉中瞬时表达同时得到了验证。
参考资料
孔静静. 藻类耐盐基因的克隆及转化棉花的初步研究[D].河南大学,2013.
