【求助】western blot 老做不出来

家请帮帮忙吧！

我从 MDCK 细胞上抽提胞浆蛋白和核蛋白，胞浆蛋白浓度在 0.5-1.5 mg/ml 之间，核蛋白在 1.0-2.5 mg/ml 之间，然后我各用了 10ug 蛋白上样量来做 Western bolt 检测 IkB 类因子和 P65 因子，蛋白大小在 40KD 到 65KD 之间，用的是半干转 50mA,90 min, 转 0.22UmPVDF 膜后把胶拿去染色，没残留有目的条带区域蛋白，说明蛋白已经转印在膜上了，但是做了很多次了都没有曝光出条带来，用的是 supersignal ECL 试剂盒曝光的。

 

之前怀疑所配试剂有问题，但是把所有试剂都重新配过了，还是一样的结果！实在找不出什么原因了。现在想会不会是上样量太低了？

请帮帮忙，实验已经进行了半年了，可是一点进展都没有，心里焦急死了！谢谢回复！

1，你的上样量肯定是够的，这个没问题。

2，建议你下次用 0.45um 的 PDVF 膜，我的经验是，大孔径的膜比小孔径的膜更容易出条带。（不知道具体原因）

3，半干转膜时间 1 hr 足以，不过 1.5 hr 也不是不行，这个不是主要原因。

4，建议换一种 ECL 试剂盒曝光，例如下次再做曝光时可以先借用别人的其它型号的 ECL 试剂盒试一下，如果出来了则说明是 ECL 试剂盒的问题。

 

就我个人认为，高度怀疑是 2 或者 4 中的某一步出了问题。

doctormy wrote:
改进建议：
1、上样量加大到 30-50ug
2、延长曝光时间

首选1

先用 actin 之类的跑一次 WB, 如果能出来条带, 那么抗体的问题要重点考虑

 

如果也不出来条带, 那么再考虑操作 protocol 上的问题.

chuckdouble wrote:

他的浓度是 0.5-1.5 mg/ml, 如果想加 30ug 就得上样 60ul-20ul, 不知道有没有能上 60ul 的样

 

 

难道他还会不知道得重新提蛋白吗？！

chuckdouble 战友，科研思维活跃一些好吗？！

doctormy wrote:
难道他还会不知道得重新提蛋白吗？！
chuckdouble战友，科研思维活跃一些好吗？！

chuckdouble wrote:
呵呵, 不知道这位战友有没有自己动手养过细胞,想 cytosolic 和 nuclei 分离开,而且还要满足 30-50 的蛋白量的话,要多大的碟子上养多少数量级密度的细胞吗?

而且他这个是细胞株还好一点,如果是原代的其他细胞的话, 要杀多少动物啊. 呵呵, 而且重新提蛋白意味着很有可能要重新造模,先不提时间和金钱, 伦理委员会将如何,呵呵

没有实践就没有发言权！

 

我曾做过四个肝癌细胞系的胞浆、胞核蛋白蛋白分离提取，通常体积小一点的细胞（如 hepG2），按两个 25 ml 的培养瓶长满 80% 左右的细胞为一组（总过约 undefined106），即便用国产的试剂盒，胞核蛋白浓度也没有下过 3.0（总量约 30ul），提蛋白的最终蛋白浓度是和很多因素（提取效率、裂解液的比例、蛋白酶抑制剂的使用等等）有关的，不单单取决于细胞数量的多少，这点亲自提过蛋白的人都会知道的。

 

楼主的细胞为常用于病毒学研究的犬肾细胞系，其比 hepG2 略大一些，你往原代上扯什么呢？即便原代细胞就提不到 3.0 吗，呵呵，以偏概全。还有，不至于提个蛋白就把伦理委员会找来的，放心好了，:D:D，否则我身边的哥们每天得接待一两回啊！:D 还有，原代细胞数量的多少并不与动物数量成统一比例的，是要看组织来源的，这一点应该不难懂的。

 

chuckdouble wrote:

他的浓度是 0.5-1.5 mg/ml, 如果想加 30ug 就得上样 60ul-20ul, 不知道有没有能上 60ul 的样

 

 

即便楼主有 60μl 的蛋白样，我想他也不会有把它们一次全加上去的想法，因为他知道他做的是 western blot，因为他肯定见过、肯定知道 western 的电泳槽是什么样子，浓缩胶上样的孔道多大、多深！:D

为什么不用丽春红把 PVDF 膜染下看看有没有转上，而去染胶呢？胶上没有蛋白不一定说明膜上一定有啊。半干法转一般都是按照膜面积来算电流的，50mA 转 90 min 是否可能转过了呢？

我觉得 0.22 的膜就是特别不好用，我之前做一个 30 多 KD 的蛋白一直用 0.22 的膜很难做出来，后来换成 0.45 的就好多了。。强烈建议你用 0.45 的。我们实验室有做 10 几 KD 的蛋白，都用 0.45 的膜都能做出来

lihuaibiao wrote:
为什么不用丽春红把 PVDF 膜染下看看有没有转上，而去染胶呢？胶上没有蛋白不一定说明膜上一定有啊。半干法转一般都是按照膜面积来算电流的，50mA 转 90min 是否可能转过了呢？