哺乳动物细胞基因/基因组编辑
泓迅生物
基因编辑技术的飞速发展, 特别是近年来 CRISPR 技术的广泛应用,使得人类拥有了前所未有的改变和修饰基因组的能力。CRISPR 技术来源于细菌本身对抗噬菌体的「免疫系统」,这项技术利用单链引导 RNA(sgRNA) 和 Cas9 蛋白,可以在体内和体外简单、迅速、低成本实现基因编辑。利用 CRISPR 技术不仅可以对编码基因进行有效编辑和基因组的大规模筛选,而且还可以结合 NGS 对非编码 RNA(ncRNA)进行功能研究。CRISPR 技术已经广泛应用于全球各个实验室,几乎可以对所有细胞系和大多数常用实验动物的遗传物质进行改造。CRISPR 技术在人类遗传性疾病、病毒感染疾病和癌症的相关研究中具有广阔前景和巨大发展潜力。
操作流程:
1、靶位点确认及 sgRNA 设计
2、构建哺乳动物细胞 Cas9/sgRNA 载体
3、sgRNA 活性验证
4、细胞转染
5、筛选特定表型细胞
6、基因组 NGS 测序
7、建立稳定敲除的细胞株
研究思路:
1. 哺乳动物细胞基因敲除(knock-out)/敲入(knock-in)
(1)sgRNA 设计
基因组定制化的 sgRNA 设计
基因组或者 Panel 范围内的基因调取与 sgRNA 设计
(2)CRISPR-Cas9 载体系统构建
(3)KO/KI 验证与分析
体外 sgRNA 活性验证
体内 sgRNA 活性验证
(4)细胞株或者动物模型构建
稳定细胞株构建
基因敲除动物模型构建
2. 哺乳动物细胞非编码 RNA 功能研究
(1)pg-sgRNA 设计
基因组或者 Panel 范围内的基因调取与 pg-sgRNA 设计
(2)CRISPR-Cas9 pg-sgRNA 文库构建
(3)病毒文库制备与 NGS 验证与分析
慢病毒文库包装
NGS 验证文库质量
(4)细胞株水平的靶标筛选
筛选前后 NGS 数据对比
细胞株构建或动物模型建立
参考文献: Ran, F.A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols, 2013. 8(11): p. 2281-2308.