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哺乳动物细胞基因/基因组编辑

泓迅生物

4165

基因编辑技术的飞速发展, 特别是近年来 CRISPR 技术的广泛应用,使得人类拥有了前所未有的改变和修饰基因组的能力。CRISPR 技术来源于细菌本身对抗噬菌体的「免疫系统」,这项技术利用单链引导 RNA(sgRNA) 和 Cas9 蛋白,可以在体内和体外简单、迅速、低成本实现基因编辑。利用 CRISPR 技术不仅可以对编码基因进行有效编辑和基因组的大规模筛选,而且还可以结合 NGS 对非编码 RNA(ncRNA)进行功能研究。CRISPR 技术已经广泛应用于全球各个实验室,几乎可以对所有细胞系和大多数常用实验动物的遗传物质进行改造。CRISPR 技术在人类遗传性疾病、病毒感染疾病和癌症的相关研究中具有广阔前景和巨大发展潜力。

操作流程:

1、靶位点确认及 sgRNA 设计

2、构建哺乳动物细胞 Cas9/sgRNA 载体

3、sgRNA 活性验证

4、细胞转染

5、筛选特定表型细胞

6、基因组 NGS 测序

7、建立稳定敲除的细胞株

研究思路:

1. 哺乳动物细胞基因敲除(knock-out)/敲入(knock-in)

(1)sgRNA 设计

  • 基因组定制化的 sgRNA 设计

  • 基因组或者 Panel 范围内的基因调取与 sgRNA 设计

(2)CRISPR-Cas9 载体系统构建

(3)KO/KI 验证与分析

  • 体外 sgRNA 活性验证

  • 体内 sgRNA 活性验证

(4)细胞株或者动物模型构建

  • 稳定细胞株构建

  • 基因敲除动物模型构建

2. 哺乳动物细胞非编码 RNA 功能研究

(1)pg-sgRNA 设计

  • 基因组或者 Panel 范围内的基因调取与 pg-sgRNA 设计

(2)CRISPR-Cas9 pg-sgRNA 文库构建

(3)病毒文库制备与 NGS 验证与分析

  • 慢病毒文库包装

  • NGS 验证文库质量

(4)细胞株水平的靶标筛选

  • 筛选前后 NGS 数据对比

  • 细胞株构建或动物模型建立


参考文献: Ran, F.A., et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols, 2013. 8(11): p. 2281-2308.

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