对外周血中人自然杀伤（NK）细胞群的表型表征分析

概述：

• 制定 10 色免疫表型 Panel，以鉴定人自然杀伤细胞（NK）。

• 用于量化 NK 细胞群子集的设门策略。

介绍：

NK 细胞属于固有免疫系统的一部分，并与肿瘤监测和病毒感染细胞的杀伤相关。最近，有研究表明，NK 细胞在自身免疫病方面也发挥着作用，其方式为调节适应性免疫反应，即 T 细胞，或与巨噬细胞和树突细胞等其他调节细胞相互作用。我们着重对 1 型糖尿病患者与健康人体的 NK 细胞区室进行了表型和功能方面的对比。此外，我们还对比了 CD56^hi/CD16^lo 和 CD56^lo/CD16+ NK 细胞比例，并监测了细胞表面受体的差异表达，包括 CD8、CD11c、CD38、CD57 和 CD117，及其表达水平。

样品制备：

1. 加入 35 mL 新鲜人血（取自血库）和 20 mLPBS。

2. 向 50 mL 锥形试管中加入 15 mL Ficoll-Paque，并转移 35 mL 经过 PBS 稀释的血样。

3. 以室温 400 x G 持续离心试管 30 分钟。

4. 用一个 (10-25 mL) 移液器或塑料的巴斯德吸管轻轻从试管中吸取间期细胞，并转移到一个新的 50 mL 锥形试管中。

5. 用无菌 PBS 将上述锥形试管填满（至 50 mL)。介绍样品制备。

6. 洗涤。在室温、低速制动条件下，以 300 X g 离心分离试管 10 分钟。

7. 裂解红细胞（BD 产品目录号：555899，10 x 溶液。在蒸馏水中使用 1 x 溶液。室温孵育 15 分钟。）

8. 将 1x10⁶ PBMC 重悬于 20 μL 染色缓冲液中（PBS 含有 5% 正常人血清）。

9. 加入抗体：CD117-BV421 (c-kit)、CD7-BV510、CD57- BV605、CD8-BV650、CD14-PE、CD19-PE、CD3-PE、CD66b-PE、CD56-PE-Cy7、CD11c-APC、 CD45-AF700、CD38-APC-AF750（每次测试 5μL），以及 CD16-FITC（每次测试 20 μL），并在冰上孵育 30 分钟。

10. 在 4℃ 条件下，300 x G 离心细胞 5 分钟。

11. 吸取上清液。

12. 重悬到 500 μL 染色缓冲液中。

13. 通过 CytoFLEX 获取结果。

通过 CytoFLEX 进行数据采集：

1. 创建新补偿值。

2. 如适用，分别检查各项单色补偿值，并更改增益值。

3. 获取单色补偿值（采用 VersaComp 微球，产品目录号：B22804）。

4. 创建新实验。

5. 导入先前针对 BV421、BV510、BV605、BV650、FITC、PE、PE-Cy7、APC、AF700 以及 APCAF750 创建的补偿设定值。

6. 创建以下图区：CD45-SSC，圈选 CD45+ 细胞；FSC-SSC，圈选淋巴细胞；FSC-A-FSC-W，圈选单细胞；被排除细胞与 CD7，圈选 exclusion -/CD7+ 细胞；CD16-CD56，圈选 CD56^hi/CD16^lo 和 CD56^lo/CD16+ 细胞；针对每个 NK 细胞子集（CD56 ^hi/CD16^lo 和 CD56^lo/CD16+）显示以下图区：c-kit-CD38、CD57-CD11c，以及 CD57-CD8。

7. 在培养基中运行样品。

8. 自动调整，实现缩放。

9. 获取 25 万至 50 万个 events。

10. 调节补偿值。

11. 保存数据。

12. 导出至 FCS。

13. 通过 Kaluza 进行分析。

结论：

NK 细胞与自身免疫病相关，并可能在 T1D 进程中发挥作用，其发挥作用的方式为创建有利于破坏胰岛β 细胞的调节环境。当前的 Panel 旨在鉴定健康人体与 T1D 患者的 NK 细胞子集在表型方面存在的差异。最终目标是构建对 T1D 疾病早期、发病前阶段具有预测意义的生物标记物。

图例说明：

取自健康供体的 PBMC， 并用 CD117-BV421 (c-kit)、CD7-BV510、CD57-BV605、CD8-BV650、CD14-PE、CD19-PE、CD3-PE、CD66b-PE、CD56-PE-Cy7、CD11c-APC、CD45-AF700、CD38-APC-AF750 以及 CD16-FITC 予以染色。NK 细胞被定义为 CD45+、CD7+、CD19-/CD3-/CD14-/CD66b-（排除 -）。在 FSC-A 与 FSC-W 图中，可以通过电子设门的方式排除聚集体。在人体中，可以通过细胞表面抗原 CD56 和 CD16 对两个主要 NK 子集进行鉴定，即 CD56 ^hi/ CD16^lo 和 CD56^lo/CD16+。基于 CD57、CD11c、CD8、CD38 和 CD117 (c-kit) 表达，CD56^hi/CD16^lo 和 CD56^lo/CD16+ NK 细胞可以进一步分裂。