原理
NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中，能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞，无需抗原或有丝分裂原刺激，也不依赖抗体或补体，在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。通过将同位素51Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞Libr（黑色素瘤细胞），按一定细胞比例与效应细胞（NK或LAK）孵育4小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的51Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。
材料与仪器
细胞系
FCS RPMI 1640 51Cr
培养瓶 培养板 CO2孵箱 离心机 β-液闪仪 γ-计数仪
FCS RPMI 1640 51Cr
培养瓶 培养板 CO2孵箱 离心机 β-液闪仪 γ-计数仪
步骤
一、 效应细胞的制备
1. NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。
2. LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腺水）中分离的淋巴细胞（1×106/ml）在含有高剂量IL-2（200~1000 ul/ml）的10%FCS RPMI 1640诱导2~5 d 而成。
二、杀伤试验
1. 51Cr4h释放试验
（2）取1×106细胞（0.5 ml），加Na251CrO4 100 uCi，37度孵育2~3 h，每15 min 轻轻振摇一次。
2. 3H-TdR释放试验
1. NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。
2. LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腺水）中分离的淋巴细胞（1×106/ml）在含有高剂量IL-2（200~1000 ul/ml）的10%FCS RPMI 1640诱导2~5 d 而成。
二、杀伤试验
主要有51Cr 4 h 释放法和3H-TdR释放法，前者操作时间短，非常敏感；后者需要无菌操作，所需时间较长。
1. 51Cr4h释放试验
（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×106/ml
（2）取1×106细胞（0.5 ml），加Na251CrO4 100 uCi，37度孵育2~3 h，每15 min 轻轻振摇一次。
（3）用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800 rpm、5 min。
（4）重悬细胞浓度1×105/ml。
（5）96孔v型或U型培养板中，每孔加100 ul（1×104细胞），设3个复孔。
（6）每孔加入100 ul 不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100 ul 1%Triton X-100；自然释放组加100 ul 完全培养基。
（7）200g离心1 min。
（8）37度、CO2孵箱培养4 h。
（9）200 g 离心1 min。
（10）每孔取出100 ul 上清，β计数仪测定值。
（11）计算：特异性杀伤率（%）=（实验组cpm-自然释放cpm）/（对照组-自然释放cpm）
2. 3H-TdR释放试验
（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等），洗涤后调整细胞浓度为2×106/ml，加3H-TdR 20 uCi。
（2）7度孵育2~3 h。
（3）用10%FCS RPMI 1640洗涤3次，每次800 rpm、5 min，调整浓度为1×105/ml。
（4）96孔U型或平底培养板中，每孔加100 ul（1×104细胞），设3个复孔。
（5）每孔加入100 ul 不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100 ul 1%Triton X-100；自然释放组加100 ul 完全培养基。
（6）CO2孵箱培养18~24 h。
（7）每孔取出100 ul 上清，加入胰蛋白酶（终浓度0.15%）和DNA酶（终浓度为0.0125%）
（8）继续孵育30 min。
（9）用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。
（10）烤干后，β计数仪测定值。
（11）计算：特异性杀伤率（%）=（1-实验组cpm/对照组cpm）×100%
注意事项
1. 每次试验最好取3~4个不同的效应细胞/靶细胞比例，常用效靶比例为100：1、50：1、25：1、12.5：1。
2. 诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。
3. 避免同位素污染。
根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，常用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞（见表）。
1个溶解单位（Lyticunit，LU）为一定效应细胞30%溶解（杀伤）5×103/靶细胞（K562）的水平。
如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。具体方法是将Percoll分离的位于第2、3梯度间的细胞洗涤后，调整细胞浓度为5×106/ml，移入试管，加入2 ml FCS和2 ml 1×108/mlSRBC，100 g 离心5 min，29度孵育1 h，轻轻重悬细胞，叠加于3 ml Ficoll上，400 ug 室温下离心30 min，界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可大于90%。
在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用NH4Cl方法，因为后者可降低NK功能。
在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄，三周内或3月龄以上小鼠的NK水平一般很低。
来源：丁香实验
