原理
NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中，能杀伤某些肿瘤细胞、病毒感染靶细胞，无需抗原或有丝分裂原刺激，亦不依赖抗体或补体，在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。
LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。
通过将同位素51Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞LiBr（黑色素瘤细胞），按一定细胞比例与效应细胞（NK或LAK）孵育4 小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的51Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。
LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下，获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能，在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。
通过将同位素51Cr掺入到NK的靶细胞K562（红白细胞白血病细胞）或LAK的靶细胞LiBr（黑色素瘤细胞），按一定细胞比例与效应细胞（NK或LAK）孵育4 小时，根据细胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的51Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。
材料与仪器
K562 LiBr
3H-TdR 51Cr FCS RPMI1640 rHu IL-2
培养瓶 培养板 CO2孵箱 液闪仪 计数仪
3H-TdR 51Cr FCS RPMI1640 rHu IL-2
培养瓶 培养板 CO2孵箱 液闪仪 计数仪
步骤
一、效应细胞的制备
NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。
LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腹水）中纯化的淋巴细胞（1×106 /ml）在含有高剂量IL-2（200～1000 μ/ml）的10 ％FCS RPMI1640 诱导2～5 天而成。
二、杀伤试验
主要有4 h 51Cr释放法和3H-TdR释放法，前者要求51Cr质量好，同位素半衰期较短，操作所需时间短；后者需要无菌操作，所需时间较长。
1. 51Cr 4 小时释放试验
（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562，LiBr等）洗涤后调整细胞浓度为2×106 /ml
（9）计算
2. 3H-TdR释放试验
（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等）洗涤后调整细胞浓度为2×106 /ml，加3H-TdR 20 μci
（11）计算
NK功能效应细胞可取静止的PBMC，或经不同细胞因子诱导的PBMC。
LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）或体液（癌性胸腹水）中纯化的淋巴细胞（1×106 /ml）在含有高剂量IL-2（200～1000 μ/ml）的10 ％FCS RPMI1640 诱导2～5 天而成。
二、杀伤试验
主要有4 h 51Cr释放法和3H-TdR释放法，前者要求51Cr质量好，同位素半衰期较短，操作所需时间短；后者需要无菌操作，所需时间较长。
1. 51Cr 4 小时释放试验
（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562，LiBr等）洗涤后调整细胞浓度为2×106 /ml
（2）取1×106细胞（0.5 ml），加Na251CrO4 100 μci，37 ℃孵育2～3 h，每15 min轻轻振摇一次
（3）用10 ％FCS RPMI1640洗涤3 次，每次800 rpm，5 min
（4）重悬细胞浓度1×105 /ml
（5）96 孔V型或U型培养板中，每孔加100 μl（1×104细胞），每份3 个复孔
（6）每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加入100 μl，1 ％TritonX-100；自然释放组加100 μl完全培养基
（7）200 g 离心1 min，37 ℃、CO2孵箱 4 h，200 g 离心1 min
（8）每孔取出100 μl上清，γ计数仪上测定cpm值
（9）计算
实验组cpm-自然释放cpm
特异性杀伤率（％）＝─────────────
最大释放cpm-自然释放cpm
2. 3H-TdR释放试验
（1）收获处于对数生长期的靶细胞（K562、LiBr等）洗涤后调整细胞浓度为2×106 /ml，加3H-TdR 20 μci
（2）37 ℃孵育2～3 h
（3）用10 ％FCS RPMI1640洗涤3 次，每次800 rpm，5 min 调整细胞浓度为1×105 /ml
（4）96 孔U型或平底培养板中，每孔加100 μl（1×104细胞），每份3个复孔
（5）每孔加入100 μl不同细胞浓度的效应细胞，最大释放组加100 μl 1％TritonX-100，自然释放组加100 μl完全培养基
（6）CO2孵箱培养18～24 h
（7）每孔吸出100 μl上清，加入胰蛋白酶（终浓度0.15 ％）和DNA酶（终浓度为0.0125 ％）
（8）继续孵育30 min
（9）用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上
（10）干燥后，移入液闪瓶中，加入1 ml闪烁液，β液闪仪中测cpm值
（11）计算
实验组cpm
特异性释放率（％）＝(1- ────── )×100％
对照组cpm
注意事项
1. 每次试验最好取3～4 个不同效应细胞/靶细胞比例，常用效靶比例为100∶1，50∶1，25∶1，12.5∶1。
2. 诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。
3. 避免同位素污染。
4. 根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞。
（2）如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。具体方法是将Percoll分离的位于第2梯度的细胞洗涤后调整细胞浓度为5×106 /ml，移入试管，加入2 mlFCS和2 ml 1×108 /ml SRBC，100 g离心5 min，29 ℃孵育1 h，轻轻重悬细胞，叠加于3 ml Ficoll上，400 g室温下离心30 min界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可>90％。
（3）在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用NH4Cl方法，因为后者可降低NK功能。
（4）在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄，不同小鼠系NK活性有明显的差别
2. 诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。
3. 避免同位素污染。
4. 根据实验需要，可采用纯化的NK细胞作为效应细胞，用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞。
（1）1个溶解单位（Lytic unit，LU）为一定效应细胞30 ％溶解（杀伤）5×103靶细胞（K562）的水平。
（2）如需进一步纯化LGL，可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞（T细胞），因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体（ER）。具体方法是将Percoll分离的位于第2梯度的细胞洗涤后调整细胞浓度为5×106 /ml，移入试管，加入2 mlFCS和2 ml 1×108 /ml SRBC，100 g离心5 min，29 ℃孵育1 h，轻轻重悬细胞，叠加于3 ml Ficoll上，400 g室温下离心30 min界面不形成花环的细胞即为LGL，纯度可>90％。
（3）在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时，如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞，可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞，而不用NH4Cl方法，因为后者可降低NK功能。
（4）在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄，不同小鼠系NK活性有明显的差别
（5）3周以内或超过3个月以上小鼠的NK水平一般很低。
来源：丁香实验
